Geelielektroforeesi on yleisesti käytetty laboratoriotekniikka, jolla on monia käytännön sovelluksia, mukaan lukien DNA-sormenjälkien ottaminen ja genomin sekvensointi. Prosessiin kuuluu erottaminen DNA fragmentteja käyttämällä sähkövirtaa seuraten samalla molekyyliliikkeen nopeutta suodatusgeelin läpi.
Lisäämällä sinistä tai oranssia jäljitysväriä värittömiin DNA-näytteisiin voit nähdä näytteesi ja saada tietoa siitä, miten DNA-molekyylit liikkuvat elektroforeesin aikana. Tunnistaminen perustuu geelin DNA-vyöhykkeiden kokoon molekyylien migraation jälkeen.
Kuinka geelielektroforeesi toimii
Geelielektroforeesi vetää DNA-fragmentit geelin läpi käyttämällä sähkövirtaa eristämään ja tunnistamaan DNA-molekyylit koon ja sähkövarauksen mukaan. Geeli valmistetaan usein agaroosijauhe - polysakkaridi, joka on uutettu merilevä.
Agaroosi lisätään puskuriliuokseen, jossa on vettä ja suolaa, ja seosta kuumennetaan ja jäähdytetään huokoisen geelin valmistamiseksi, joka toimii suodatusmatriisina elektroforeesimenetelmän aikana. Geeli asetetaan sitten elektroforeesiyksikköön ja peitetään johtavalla puskuriliuoksella
sähköä.DNA: ta ja täyteaineita sisältävät liuokset pipetoidaan pieniin kuoppiin geelissä, joka on tehtävä geelin valmistuksen aikana. Väriaineetauttaa sinuanähdä selvästi näyte että lisäät geelikaivoihin, jotka sijaitsevat lähellä elektroforeesiyksikön negatiivista elektrodia.
Positiivinen elektrodi sijaitsee vastakkaisessa päässä. Tunnettu DNA-fragmenttien standardi sijoitetaan ensimmäiseen kuoppaan, joka luo tikkaat DNA-juovia vertailua ja tunnistamista varten.
DNA-molekyylien fosfaattirunko antaa DNA: lle negatiivisen varauksen. Vastakohdat houkuttelevat, joten DNA-molekyylit houkuttelevat positiivista elektrodia ja alkavat liikkua tai "siirtyä", kun sähkövirta kytketään päälle.
Pienemmät DNA-fragmentit kulkevat nopeammin kuin suuremmat fragmentit, koska ne kohtaavat vähemmän vastustuskykyä kulkiessaan geelin huokoisen matriisin läpi. Samankokoiset DNA-fragmentit muodostavat DNA-juovia geelissä.
Väriaineen käyttötarkoitus ja merkitys
DNA on väritöntä, joten lisäämällä jäljitysvärit näyte auttaa sinua määrittää liikkumisnopeus erikokoisia proteiinimolekyylejä geelissä elektroforeesin aikana. Esimerkkejä DNA-näytteen mukana liikkuvista latausväreistä ovat bromifenolisininen ja ksyleenisyanoli.
Valitun väriaineen ei tulisi olla reaktiivinen tai muuttaa DNA: ta. Bromifenolisininen on väriaine, jota käytetään jäljittämään pienempiä DNA-säikeitä, jotka sisältävät noin 400 emäsparia, kun taas ksyleenisyanoli on parempi suuremmille DNA-säikeille, joissa on jopa 8000 emäsparia. Valitun väriaineen ei tulisi olla reaktiivinen tai muuttaa DNA: ta.
Glyserolin rooli agaroosigeelielektroforeesissa
Kun valmistelet DNA-näytettä elektroforeesi, sinun on lisättävä glyserolia ja vettä sekä väriaineita. Glyseroli on raskas, siirappimainen aine, joka antaa enemmän tiheyttä DNA-näytteelle ennen kuin se työnnetään geelilevyn toisen pään kuoppiin.
Ilman glyserolia DNA-näyte hajoaisi sen sijaan, että uppoisi ja muodostaisi kaivoon kerroksen, kuten sen pitäisi tehdä DNA-tikkaiden muodostamiseksi.
Väriaineen seuranta SDS PAGE -sivulla
Natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS PAGE) on tekniikka, joka soveltuu proteiinien ja aminohappojen erottamiseen, jotka ovat pienempiä ja monimutkaisempia kuin lineaariset DNA-molekyylit. Polyakryyliamidia (SDS PAGE -geeli) käytetään agaroosigeelin sijasta elektroforeesissa.
Bromifenolisininen (BPB) lisätään näytepuskuriin a jäljitysväri joka liikkuu proteiinien erottamisen samaan suuntaan ja rajaa niiden etureunan.
DNA: ta sitovan väriaineen rooli
DNA: ta sitova väriaine, kuten oranssinvärinen etidiumbromidia voidaan lisätä geeliin tai elektroforeesipuskuriin. Kuten nimestä voi päätellä, väriaine kiinnittyy DNA-molekyyliin.
Tämän mutageenisen väriaineen käsittelyssä on oltava erittäin varovainen, koska se voi sitoutua ihosolujen DNA: han. Toisin kuin jäljitysvärit, etidiumbromidi fluoresoi kirkkaasti alle UV-valo, jolloin DNA-vyöhykkeet näkyvät.