Western blot, analyyttinen tekniikka, jota käytetään tietyn näytteen spesifisen proteiinin määrittämiseen, käyttää entsyymin tai fluoresenssileimatun primaarisen vasta-aineen kykyä sitoutua spesifiseen antigeeniin. Se on kolmivaiheinen prosessi, joka alkaa geelielektroforeesilla, jota seuraa kalvopuhdistus ja koettelu vasta-aineilla. Proteiinin havaitseminen voi olla suora tai epäsuora, jälkimmäisessä käytetään leimattua sekundääristä vasta-ainetta, joka on suunnattu primaaria vastaan. Vaikka Western blot hyväksytään rutiiniproteiinianalyysitekniikaksi, sillä on rajoituksia ja etuja.
Etu: Herkkyys
Yksi suurimmista argumenteista Western blotin puolesta on sen herkkyys. Koska tekniikka kykenee havaitsemaan näytteestä vain 0,1 nanogrammaa proteiinia, se voi teoriassa toimia tehokas varhainen diagnostiikkatyökalu, joka tunnistaa potilaan pienimmänkin viruksen tai bakteerin aiheuttaman immunogeenisen vasteen näyte. Epäsuora Western-blotti rakentaa edelleen tätä herkkyyttä toissijaisen vasta-aineen kyvystä vahvistaa kuvantamisjärjestelmän havaitseman signaalin voimakkuutta. Suurempi herkkyys tarkoittaa, että testaukseen tarvitaan vähemmän vasta-aineita, mikä vähentää laboratorion kustannuksia merkittävästi.
Etu: Spesifisyys
Western blot -tekniikka velkaa spesifisyytensä kahdelle suurelle tekijälle. Ensinnäkin geelielektroforeesi lajittelee näytteen erikokoisiksi, varauksellisiksi ja konformaarisiksi proteiineiksi. Tämä prosessi itsessään on valtava askel kohti havaitsemista, koska geeliin muodostuneet nauhat antavat jo vihjeitä kiinnostavan proteiinin tai polypeptidin koosta. Vasta-aine-antigeeni-vuorovaikutuksen spesifisyys toimii toisena suurena tekijänä. Koska spesifiset vasta-aineet osoittavat affiniteettia spesifisiin proteiineihin, prosessi voi selektiivisesti havaita kohdeproteiinin jopa 300 000 eri proteiinin seoksessa.
Haitta: taipumus vääriä tai subjektiivisia tuloksia
Herkkyydestään ja spesifisyydestään huolimatta western blot voi silti tuottaa virheellisiä tuloksia. Vääriä positiivisia tuloksia, kun vasta-aine reagoi ei-tarkoitetun proteiinin kanssa, mikä on usein tapahtuu, kun potilaalla, jolla on HIV-testi, sattuu tuberkuloosi tai useita loisia infektiot. Väärä-negatiivinen puolestaan voi johtaa helposti, jos suuremmille proteiineille ei anneta riittävästi aikaa siirtyä kunnolla membraaniin. Väärä blottaus ja käsittely tuottavat usein vinoja, haalistuneita tai jopa useita kaistoja, jolloin testitulokset riippuvat teknikon tulkinnasta.
Haitta: korkea hinta ja tekninen kysyntä
Western-blotin hinta on yhdistelmä merkittyistä vasta-aineiden, ammattitaitoisten analyytikoiden ja laboratoriolaitteiden suurista yksittäisistä kustannuksista. Herkkä prosessi, Western-blottaus vaatii tarkkuutta jokaisessa vaiheessa näytteen ainesosien tunnistamiseksi oikein. Pieni virhe reagenssipitoisuudessa tai inkubointijaksossa voi olla tuhoisa koko prosessille. Lopuksi havaitsemiseen ja kuvantamiseen tarvittavat laitteet - kemiluminesoivat, fluoresoivat, radioaktiiviset tai laserilmaisimet - voivat olla liian kalliita keskimääräiselle mikrobiologiselle yksikölle.