Restriktioentsyymien löytämisen jälkeen molekyylibiologian ala on kehittynyt nopeasti, koska näiden proteiinien ainutlaatuinen kyky katkaista DNA tietyllä tavalla Nämä yksinkertaiset entsyymit ovat vaikuttaneet syvällisesti tutkimukseen kaikkialla maailmassa; kummallakin tavalla meillä on bakteereja kiittää tästä tieteellisestä lahjasta.
Rajoitusentsyymin ominaisuudet ja tyypit
Rajoitusentsyymit, joita kutsutaan myös restriktioendonukleaaseiksi, sitoutuvat DNA: han ja pilkkovat kaksoisjuosteen muodostaen pienempiä DNA-paloja. Restriktioentsyymejä on kolme tyyppiä; Tyypin I restriktioentsyymit tunnistavat DNA-sekvenssin ja leikkaavat juosteen satunnaisesti yli tuhannen emäsparin päässä kohdasta. Tyypin II restriktioentsyymit, jotka ovat hyödyllisimpiä molekyylibiologian laboratorioille, tunnistavat ja leikkaavat DNA-juosteen ennustettavasti tietyllä sekvenssillä, joka on yleensä alle kymmenen emäsparia pitkä. Tyypin III restriktioentsyymit ovat samanlaisia kuin tyyppi I, mutta nämä leikkaavat DNA: n noin kolmekymmentä emäsparia tunnistussekvenssistä.
Lähteet
Bakteerilajit ovat tärkein kaupallisten restriktioentsyymien lähde. Nämä entsyymit suojaavat bakteerisoluja vieraiden DNA: n hyökkäyksiltä, kuten nukleiinihapposekvensseistä, joita virukset käyttävät replikoitumaan isäntäsolun sisällä. Pohjimmiltaan entsyymi pilkkoo DNA: n paljon pienemmiksi paloiksi, jotka eivät aiheuta juurikaan vaaraa solulle. Entsyymit on nimetty sitä tuottavien bakteerilajien ja -kantojen mukaan. Esimerkiksi ensimmäistä Escherichia coli -kannasta RY13 uutettua restriktioentsyymiä kutsutaan EcoRI: ksi, ja viidestä samasta lajista uutettua entsyymiä kutsutaan EcoRV: ksi.
Mukavuus laboratoriossa
Tyypin II restriktioentsyymien käyttö on lähes yleistä laboratorioissa ympäri maailmaa. DNA-molekyylit ovat erittäin pitkiä ja niitä on vaikea hallita oikein, varsinkin jos tutkija on kiinnostunut vain yhdestä tai kahdesta geenistä. Rajoitusentsyymien avulla tutkija voi leikata DNA: n luotettavasti paljon pienempiin osiin. Tämä kyky manipuloida DNA: ta on mahdollistanut restriktiokartoituksen ja molekyylikloonauksen etenemisen.
Rajoituskartoitus
Laboratorioympäristössä on erittäin hyödyllistä ja kätevää tietää tietyt restriktiokohdat tarkasti DNA-juosteessa. Jos DNA-sekvenssi tunnetaan, restriktiokartoitus voidaan tehdä tietokoneella, joka voi nopeasti kartoittaa kaikki mahdolliset restriktioentsyymien tunnistussekvenssit. Jos DNA-sekvenssiä ei tunneta, tutkija voi silti luoda yleisen kartan käyttämällä erilaisia entsyymejä itse ja yhdessä muiden entsyymien kanssa molekyylin pilkkomiseksi. Deduktiivisen päättelyn avulla voidaan luoda yleinen rajoituskartta. Rajoituskartan saatavuus on kriittinen geenien kloonauksessa.
Molekyylikloonaus
Molekyylikloonaus on laboratoriotekniikka, jossa geeni leikataan tavoite-DNA-molekyylistä, yleensä uutettuna organismista, restriktioentsyymien avulla. Seuraavaksi geeni insertoidaan vektoriksi kutsuttuun molekyyliin, jotka ovat yleensä pieniä paloja pyöreä DNA, nimeltään plasmidit, jotka on modifioitu kuljettamaan useita restriktioentsyymikohteita sekvenssit. Vektori pilkotaan auki restriktioentsyymien avulla ja sitten geeni insertoidaan pyöreään DNA: han. DNA-ligaasiksi kutsuttu entsyymi voi sitten uudistaa ympyrän sisällyttääkseen kohdegeenin. Kun geeni on 'kloonattu' tällä tavalla, vektori voidaan insertoida bakteerisoluun, jotta geeni voi tuottaa proteiinia.