Kuinka näyte DNA: sta kerätään ja valmistellaan tutkimusta varten

Ennen kuin tutkijat voivat sekvensoida DNA: ta tai muuttaa sitä geenitekniikan avulla, tutkijoiden on ensin eristettävä se. Tämä saattaa tuntua vaikealta tehtävältä, koska solut sisältävät laajan valikoiman muita yhdisteitä, kuten proteiineja, rasvoja, sokereita ja pieniä molekyylejä. Onneksi biologit voivat käyttää DNA: n kemiallisia ominaisuuksia erottaakseen DNA: n näistä epäpuhtauksista ja valmistellakseen sitä jatkokokeita varten. Tätä prosessia kutsutaan DNA: n uuttamiseksi.

DNA: n uuttamiseen käytetään monia erilaisia ​​tekniikoita. Yksittäisen laboratorion käyttämä riippuu suoritettavan kokeen tyypistä ja siitä, kuinka puhtaan DNA: n on oltava. Tutkijat aloittavat yleensä näytteestä, joka sisältää soluja - esimerkiksi kudos- tai verinäytteen - ja rikkoo solut auki tai hajottaa ne. Solujen hajottamiseksi on useita tapoja. Pesuaineen lisääminen aiheuttaa niiden irtoamisen, samoin kuin altistamisen korkean taajuuden ääniaalloille. Vaihtoehtoisesti näytteen sekoittaminen lasihelmiin ja sen nopea väriseminen hajottaa solut fyysisesti ja vapauttaa niiden sisällön.

Jos suurta puhtautta ei vaadita, tutkijat voivat lisätä proteinaasi K -nimisen entsyymin hajottamaan suurimman osan näytteessä olevista proteiineista ja käyttämään sitä sellaisenaan. Tämä tekniikka on kuitenkin erittäin likainen, koska suurin osa epäpuhtauksista on edelleen läsnä, joten se soveltuu vain, jos nopeus on etusijalla ja puhtaudesta ei ole merkitystä. Toinen nopea ja likainen lähestymistapa on poistaa proteiinit lisäämällä suolapitoisuutta lisäämällä suoloja, kuten ammonium- tai kaliumasetaatti, pakottaakseen proteiinit saostumaan. Myös tämä tekniikka on melko likainen, koska monia muita epäpuhtauksia on edelleen läsnä.

Toinen lähestymistapa on solujen hajottaminen pesuaineella ja sitten liuoksen sekoittaminen isoamyylialkoholin, kloroformin ja fenolin kanssa. Sitten liuos erottuu kahteen kerrokseen. Proteiinit päätyvät ylempään orgaaniseen kerrokseen, kun taas DNA jää alempaan vesikerrokseen. Tämä tekniikka vaatii suolapitoisuuden ja pH: n tarkkaa valvontaa hyvien tulosten saavuttamiseksi. Se on aikaa vievää, ja sekä fenoli että kloroformi ovat erittäin myrkyllisiä kemikaaleja. Tämän seurauksena, vaikka fenoli-kloroformiuutot olivat kerran rutiinia, muista tekniikoista on tullut suositumpia viime vuosina.

Anioninvaihtokromatografia tarjoaa paremman puhtauden ja johdonmukaisemmat tulokset kuin fenoli-kloroformiuutto. Putki tai kolonni on täynnä pieniä hiukkasia, joissa on positiivisesti varautuneita kohtia, joihin negatiivisesti varautunut molekyyli tai anioni voi sitoutua. DNA sitoutuu näihin anioninvaihtokohtiin, kun taas muut epäpuhtaudet, kuten proteiinit ja RNA, pestään pylväästä. Myöhemmin suolapitoista liuosta käytetään DNA: n vetämiseksi pylväästä.

Nopein ja ehkä luotettavin tekniikka DNA: n puhdistamiseksi on erityisesti valmistetun paketin käyttö. Nämä sarjat sisältävät piihappogeelikalvoja putkessa. DNA tarttuu kalvoon, kun taas muut epäpuhtaudet pestään pois käyttämällä sarjaa erikoisvalmisteisia suolaliuoksia, jotka tulevat pakkauksen mukana. Lopuksi DNA pestään pylväästä vähäsuolaisella liuoksella. Nämä sarjat ovat nopeita, helppokäyttöisiä ja tarjoavat toistettavia tuloksia.

Kun DNA on eristetty ja suspendoitu uudelleen pH-kontrolloituun puskuriliuokseen, viimeinen vaihe on testata sen puhtaus. Helppo ja kätevä tapa tehdä se on tarkistaa, kuinka paljon ultraviolettivaloa se absorboi 260 ja 280 nanometrin aallonpituuksilla. Absorbtion 260 nanometrillä jaettuna absorptiolla 280 nanometrillä tulisi olla 1,8, jos DNA on puhdas. Absorbanssin mittaaminen 260 nanometrillä mahdollistaa myös DNA: n pitoisuuden määrittämisen.