Biokemistit ja molekyylibiologit käyttävät elektroforeesia makromolekyylien, kuten proteiinien ja nukleiinihappojen, erottamiseen. Tämän avulla tutkijat voivat eristää ja analysoida yksittäisiä proteiineja tai nukleiinihapposekvenssejä kompleksiseoksessa. Tyypillinen esimerkki elektroforeesista laboratoriossa on mikrobiologi, joka käyttää polymeraasiketjureaktiota (PCR) mikrobiyhteisössä tuotettujen DNA-fragmenttien erottamiseksi. Tarkoituksesta riippumatta elektroforeesi vaatii aina puskuriliuoksen käyttöä.
TL; DR (liian pitkä; Ei lukenut)
Elektroforeesi erottaa makromolekyylit, kuten proteiini ja nukleiinihapot koon, varauksen ja muiden ominaisuuksien mukaan. Elektroforeesissa, joka erottuu varauksella, tutkijat käyttävät puskuria siirtääkseen kyseisen varauksen geelin läpi. Puskuri pitää myös geelin stabiilissa pH: ssa minimoiden muutokset, joita proteiinissa tai nukleiinihapossa voi tapahtua, jos ne altistetaan epävakaalle pH: lle.
Elektroforeesin periaatteet
Elektroforeesi erottaa molekyylit gradienttia pitkin niiden koon, varauksen tai muiden ominaisuuksien perusteella. Tämä gradientti voi olla sähkökenttä tai denaturoivan gradienttigeelielektroforeesin (DGGE) tapauksessa denaturointiaine, kuten urean ja formamidin seos. Proteiinit kulkeutuvat kohti anodia, jos ne ovat negatiivisesti varautuneita, ja katodia, jos ne ovat positiivisesti varautuneita. Koska suuremmat molekyylit kulkeutuvat hitaammin kuin pienemmät molekyylit, tutkijat voivat mitata kuljetun matkan ja käyttää logaritmeja fragmenttien koon määrittämiseen.
Denaturoiva gradienttigeelielektroforeesi
DGGE: n avulla DNA liikkuu kasvavan denaturointitehon gradienttia pitkin, kunnes teho on riittävä denaturoimaan tai avautumaan kyseinen DNA-fragmentti kokonaan. Tässä vaiheessa siirto pysähtyy. Tutkijat voivat käyttää tätä menetelmää fragmenttien erottamiseen niiden yksilöllisen alttiuden perusteella denaturoinnille.
Mitä puskuri tekee
Elektroforeesissa, joka erottuu varauksen perusteella, puskurissa olevat ionit välittävät erottamiseen tarvittavan varauksen. Puskuri, joka tarjoaa heikon hapon ja emäksen säiliön, pitää myös pH: n kapealla alueella. Tämä on tärkeää, koska proteiinin tai nukleiinihapon rakenne ja varaus muuttuvat, jos niille tehdään merkittäviä pH-muutoksia, mikä estää asianmukaisen erottumisen.
Tyypilliset puskurit
Erilaiset puskurit ovat ihanteellisia elektroforeesigeelin pitämiseksi eri haluttuilla pH-alueilla. Tyypillisiä puskureita, joita tutkijat käyttävät tähän tarkoitukseen, ovat etikkahappo, boorihappo, fosforihappo ja sitruunahappo sekä glysiini ja tauriini. Yleensä pKa-arvon (hapan dissosiaatiovakio) tulisi olla lähellä vaadittua pH: ta. Meille on edullista, että puskurit tarjoavat pienen varauksen suuruuden, jotta emme johtaisi liikaa virtaa.
