Geelelektroforeesi puudused

Geelelektroforees on tehnika, kus bioloogilised molekulid eraldatakse üksteisest ja tuvastatakse bioloogiliste uuringute või meditsiinilise diagnostika abil. Alates nende väljatöötamisest 1970ndatel on need meetodid olnud hindamatud geenide (DNA) ja geeniproduktide (RNA ja valk) tuvastamisel. Viimastel aastatel on ilmnenud uuemad tehnikad, mis annavad elussüsteemides toimuvale suurema spetsiifika ja üksikasjad. Ehkki need pole elektroforeesi tehnikaid välja tõrjunud ja arenenud manipulatsioonid võivad tehnika elujõulisust laiendada, on oluline mõista, mida geelelektroforees suudab ja mida mitte.

Elektroforees on spetsiifiline igale koele, mille proovist olete proovinud. Näiteks kui käivitate Southern blot (teatud tüüpi elektroforeesi) põsepulgaga, vaatate geene oma põse epiteelirakkudest ja mitte kusagilt muust kehast. Vahel võib see olla kasulik, kuid teadlasi huvitavad sageli laiemad mõjud.

Sellised meetodid nagu in situ hübridisatsioon (ISH) võivad võtta osa koest ja analüüsida geeni ekspressiooni selle proovi igas väikeses piirkonnas. Seega saavad teadlased ISH-ga vaadata valimi kõiki ajupiirkondi, samas kui elektroforeesitehnikad saavad korraga vaadata ainult mõnda piirkonda.

Geelelektroforees võimaldab tõhusalt eraldada erineva kaaluga sarnaseid valke (seda tehnikat nimetatakse Western blottingiks). See saab neid täpsemini lahutada 2d-elektroforeesina tuntud tehnika abil; see on proteoomikas tavaline.

Paraku on kõik selle tehnika abil tehtud mõõtmised parimal juhul poolkvantitatiivsed. Valkude täpse massi (massi) saamiseks tuleb pärast valgu puhastamist elektroforeesiga kasutada massispektroskoopiat. Lisaks sõltub erinevate molekulide suhteliste koguste võrdlemine geeli erinevate laikude ribatihedusest (tumedusest). Sellel meetodil on teatud määral vigu ja puhaste tulemuste saamiseks käivitatakse proovid tavaliselt mitu korda.

Elektroforees on erinevate biomolekulide eraldamise ja visuaalse tuvastamise tehnika. Seda tehakse juhtides elektrivoolu läbi geeli erineva kaaluga laetud molekulide eraldamiseks. Kui teid huvitav molekul pole piisavalt levinud, on selle riba praktiliselt nähtamatu ja seda on raske mõõta.

DNA-d ja RNA-d saab enne elektroforeesi käivitamist mõnevõrra võimendada, kuid valkudega pole seda otstarbekas teha. Seetõttu on nende testide läbiviimiseks vaja suurt koeproovi. See võib piirata tehnika kasulikkust, eriti meditsiinilises analüüsis. Elektroforeesi käivitamine ühe raku proovide abil on praktiliselt võimatu; voolutsütomeetriat ja immunohistokeemiat kasutatakse sagedamini rakkude kaupa valkude ekspressiooni hindamiseks. PCR-nimeline tehnika sobib suurepäraselt RNA väikeste koguste täpseks mõõtmiseks.

Elektroforees on keskmiste ja suurte biomolekulide eraldamisel ja tuvastamisel suurepärane. Kuid paljud molekulid, mida teadlased soovivad vaadata, on väiksemad; väikseid hormoone, neurotransmittereid ja ioone ei saa elektroforeesiga mõõta. Seda kahel põhjusel: nad ei reageeri elektroforeesi preparaadiga (tavaliselt tehnika nimetatakse SDS PAGE) ja isegi kui nad seda teeksid, on nad liiga väikesed, et neid korralikult eraldada, ja kiirustaksid selle alt välja geel. Neid molekule mõõdetakse selle asemel selliste meetodite abil nagu RIAA-d (raadioimmunotestid) ja ELISA-d (ensüümidega seotud immunosorbantanalüüs).

Geelelektroforees on tavaliselt väikese läbilaskevõimega, mis tähendab, et see ei tooda andmeid eriti kiiresti. Kontrastelektroforees, kus saate korraga vaadata väikest käputäit RNA molekule, kasutades PCR-i (polümeraasi ahelreaktsioon), mis võimaldab samaaegselt hinnata tuhandeid proove. Samamoodi saab voolutsütomeetria abil mõõta tuhandeid üksikuid rakke ja muuta see kompleksseks korrelatsioone, samal ajal kui elektroforees vaatleb rakke massiliselt ega suuda nii hästi toimida diskrimineerimine. PCR ja voolutsütomeetria esindavad vastavalt massiliselt paralleelseid ja jadaprotsesse ning mõlemad ületavad kaugelt elektroforeesi võimeid uurimisandmete loomiseks.