DNA
Deoksüribonukleiinhape ja valgud. DNA on organiseeritud üksusteks, mida nimetatakse geenideks, millest igaüks kodeerib kindlat RNA või valgu järjestust. Geenide uurimiseks uuritakse elusüsteemide bioloogilist struktuuri ja funktsioone, evolutsiooni, haigusi ja paljusid muid aspekte. Geenide üksikasjalikuks uurimiseks tuleb DNA huvipakkuvatest rakkudest eraldada ja puhastada.
DNA ekstraheerimine
Kuigi ühe raku DNA-d saab eraldada ja uurida, ei piisa sellest vaid palja silmaga nägemiseks. Spoolimiseks piisava koguse saamiseks peate seda rohkem rakke töötama (mitu miljonit).
Täpsed protokollid varieeruvad märkimisväärselt, et võtta arvesse konkreetsete proovide ainulaadseid omadusi, kuid üldised etapid on homogeniseerimine, lüüs, seedimine, eraldamine ja kogumine. Protseduur on kõige parem läbi viia väikeses (olenevalt proovi suurusest) klaasist või plasttorust.
Rakud segatakse või jahvatatakse, et rakud üksteisest põhjalikult eraldada. See muudab raku koostisosad kättesaadavamaks järgnevatele reaktiividele. Seejärel lisatakse homogenaadile detergent või ensüümid, et lüüsida rakumembraane (ja tuumamembraane, kui rakud on eukarüootsed) DNA vabastamiseks. Sel hetkel ümbritsevad DNA valke, lipiide, süsivesikuid ja kõike muud, mis rakkudes sisaldus.
Valkude lagundamiseks võib osutuda vajalikuks täiendav ensümaatiline lagundamine, et need ei seonduks DNA-ga ega segaks selle kogumist. DNA eraldatakse ülejäänud rakusisaldusest külma, puhta, etüül- või isopropüülalkoholi lisamisega. DNA ei lahustu nendes alkoholides, nii et see tihendab kontakti alkoholiga minimeerimiseks. Seejärel koguti kondenseerunud DNA, tavaliselt tsentrifuugimise või poolitamise teel.
DNA spoolimine
DNA kogumine pooli abil on efektiivne, kui ekstraheerimisprotseduuril saadakse suur kogus DNA-d. See on ka suurepärane demonstratsioonimeetod, kuna puhta DNA muljetavaldav puntras on selgelt nähtav.
DNA spoolimiseks tuleb eraldamisetapp läbi viia hoolikalt. Kui see ei olnud osa eelnevalt lisatud lüüsireagendi segust, tuleb enne alkoholi lisamise etappi lahusele lisada kontsentreeritud soola lahus (naatriumkloriid). Külm alkohol valatakse katseklaasi küljelt aeglaselt alla, moodustades segamise vältimiseks vesilahuse peal kihi. Kui see on õigesti tehtud, moodustab alkohol soolase kihi peale oma kihi. Siis tuleb poolitamine.
DNA kogumiseks soolasest kihist asetage ettevaatlikult klaasist segamisvarras alkoholikihi kohale, kuni see puudutab tuubi põhja. Keerake varda aeglaselt sõrmede vahel, jälgides kahe kihi vahelist liidest. Kui DNA-d on piisavalt, klombub see kihtide vahelises liideses kokku, moodustades piimjas poolläbipaistva massi. Keerake varda, et ümbritseda DNA selle ümber (see on pooli osa) ja tõmmake see torust välja. DNA võib ladustamiseks või täiendavaks analüüsiks üle viia teise puhta alkoholi tuubi.