Pärast restriktsiooniensüümide avastamist on molekulaarbioloogia valdkond kiiresti arenenud tänu nende valkude ainulaadsele võimele DNA spetsiifilisel viisil lõhustada. Need lihtsad ensüümid on avaldanud sügavat mõju teadusuuringutele kogu maailmas; kummalisel kombel on meil selle teadusliku kingituse eest tänada baktereid.
Piiravate ensüümide omadused ja tüübid
Piiravad ensüümid, mida nimetatakse ka restriktsiooni endonukleaasideks, seonduvad DNA-ga ja lõhustavad kahekordse ahela, moodustades väiksemad DNA tükid. On kolme tüüpi restriktsiooniensüüme; I tüübi restriktsiooniensüümid tunnevad ära DNA järjestuse ja lõikavad ahela juhuslikult saidist kaugemale kui tuhat aluspaari. II tüüpi restriktsiooniensüümid, mis on molekulaarbioloogia laborites kõige kasulikumad, tunnevad ära ja lõikavad DNA ahela prognoositavalt spetsiifilise järjestuse korral, mis on tavaliselt vähem kui kümme aluspaari pikk. III tüübi restriktsiooniensüümid on sarnased I tüübiga, kuid need lõikavad DNA tuvastamise järjestusest umbes kolmkümmend aluspaari.
Allikad
Bakteriliigid on kaubanduslike restriktsiooniensüümide peamine allikas. Need ensüümid kaitsevad bakterirakke invasiooni eest võõr-DNA-st, näiteks nukleiinhappejärjestustest, mida viirused kasutavad peremeesrakus paljunemiseks. Põhimõtteliselt tükeldab ensüüm DNA palju väiksemateks tükkideks, mis rakku vähe ohustavad. Ensüümid on nimetatud seda tootvate bakteriliikide ja tüvede järgi. Näiteks Escherichia coli tüvest RY13 ekstraheeritud esimest restriktsiooniensüümi nimetatakse EcoRI-ks ja samast liigist ekstraheeritud viiendat ensüümi EcoRV-ks.
Labori mugavus
II tüüpi restriktsiooniensüümide kasutamine on kogu maailmas laborites peaaegu universaalne. DNA molekulid on äärmiselt pikad ja neid on raske korralikult hallata, eriti kui teadlast huvitab ainult üks või kaks geeni. Piiravad ensüümid võimaldavad teadlasel DNA usaldusväärselt palju väiksemateks osadeks lõigata. See võime DNA-ga manipuleerida on võimaldanud edendada restriktsioonide kaardistamist ja molekulaarset kloonimist.
Piirangute kaardistamine
Laboratoorsetes tingimustes on äärmiselt kasulik ja mugav teada, kus DNA ahelas teatud restriktsioonikohad asuvad. Kui DNA järjestus on teada, saab restriktsiooni kaardistada arvuti abil, mis võimaldab kiiresti kaardistada kõik võimalikud restriktsiooniensüümide tuvastamise järjestused. Kui DNA järjestus ei ole teada, saab teadlane ikkagi luua üldise kaardi, kasutades molekuli lõhustamiseks erinevaid ensüüme ise ja koos teiste ensüümidega. Deduktiivset arutlust kasutades saab luua üldise piirangukaardi. Geenide kloonimisel on kriitilise kaardi olemasolu kättesaadav.
Molekulaarne kloonimine
Molekulaarne kloonimine on laboritehnika, mille käigus lõigatakse geen sihtmärk-DNA molekulist, tavaliselt ekstraheeritakse organismist, restriktsiooniensüümide abil. Järgmisena sisestatakse geen molekuli, mida nimetatakse vektoriks, mis on tavaliselt väikesed tükid ringikujuline DNA, mida nimetatakse plasmiidideks ja mida on modifitseeritud kandma mitut restriktsiooniensüümi sihtmärki järjestused. Vektor lõigatakse restriktsiooniensüümide abil lahti ja seejärel sisestatakse geen ümmarguse DNA-sse. Ensüüm nimega DNA ligaas saab seejärel ringi reformida, et see hõlmaks sihtgeeni. Kui geen on sellisel viisil „kloonitud”, saab vektor sisestada bakterirakku, et geen saaks toota valku.
