Raku geneetiline plaan on kodeeritud selle geneetilises materjalis ehk DNA-s. Kuna DNA ei lahku kunagi raku tuumast, satub see teave tsütoplasmasse, kus teised valkude ja biokeemiliste komponentide elukoht, tuleb kõigepealt DNA transkribeerida RNS-i (mRNA või (A) RNA). Seejärel muundatakse see mRNA valkudeks, mis täidavad raku paljusid funktsioone. Väga haruldaste mRNA-de tuvastamiseks või kvantifitseerimiseks, sondide valmistamiseks mikrokiirte jaoks või komplementaarsete DNA molekulide raamatukogude ehitamiseks tuleb mRNA eraldada. Kuid kogu RNA (s.o kogu RNA rakus) ekstraheerimine ja sellele järgnev mRNA eraldamine ei välista üksteist; esimene tuleb läbi viia mRNA ekstraheerimiseks.
TRIzoli homogeniseerimine: kogu RNA sisaldab kogu mRNA, ülekande RNA, ribosomaalset RNA ja muid mittekodeerivaid RNA-d. Nende eraldamiseks teistest rakukomponentidest puruneb rakk kõigepealt lahti selle vabastamiseks sisu. Seda tehakse rakkude resuspendeerimisega tsentrifuugimisega (suurtel kiirustel ketramine) TRIzol Reagendis (Life Technologies). Sarnaselt töötavad ka teised TRIzoli versioonid (näiteks Ambioni TRI reagent).
RNA kogu eraldamine: raku erinevate komponentide (valgud, DNA, RNA) eraldamiseks suspensioonis kihtideks või faasideks kasutatakse tsentrifuugimiste sarja. Ülemine, kollase värvusega faas koosneb rasvast ja selle saab ära visata. Soovitud faas on toonitud punaseks, sisaldab kogu RNA-d ja jääb alles. Pärast fenool-kloroformiga ekstraheerimist ja rea alkoholipesu, kasutades isopropanooli ja etanooli, saab RNA granuleerida mRNA eraldamiseks. Lisage RNaasi inhibiitorid, et vältida selle ensüümi lagundamist kogu RNA-s.
mRNA ekstraheerimine: mRNA eraldamiseks on tavaline kasutada komplekti, kuna omatehtud laboriprotokollid ei tekita suuri koguseid kõrgelt puhastatud mRNA-d. Kaubanduskomplektide hulka kuuluvad Invitrogen's FastTrack 2.0 või Ambion's Poly (A) Pure mRNA Isolation Komplekt. Need komplektid on selliste komplektide jaoks ühised:
d) Tsentrifuugige see proov ja koguge supernatant, mida pestakse mitu korda komplektides sisalduvate siduvate ja vähese soolasisaldusega puhvritena.
Viited
- "cDNA raamatukogu protokollid?"; Ian G. Cowell ja Caroline A. Austin; 1997
- "In vitro transkriptsiooni- ja tõlkeprotokollid?"; Martin J. Tymms; 1995
Näpunäited
- Hoidke kõiki reaktiive, rakke ja RNA jäässe uputades külmana. See hoiab ära RNA lagunemise mis tahes muude ensüümide poolt, mis vabanevad homogeniseerimisprotsessi käigus.
Hoiatused
- Sellised reaktiivid nagu TRIzol on mürgised ega tohi kokku puutuda naha ega limaskestadega. Selle reagendi käsitsemisel järgige alati ohutuid laboriprotokolle.
Autori kohta
Palmer Owyoung on omandanud San Diegos California ülikoolis rahvusvahelise äri magistrikraadi ja a Sotsioloogia bakalaureus Santa Barbaras Californias ja on koolitatud molekul bioloog. Ta on olnud vabakutseline kirjanik alates 2006. aastast. Lisaks kirjutamisele on ta täiskohaga Forexi kaupleja ja Interneti-turundaja.
Foto autorid
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images