Biokeemikud ja molekulaarbioloogid kasutavad elektroforeesi makromolekulide, näiteks valkude ja nukleiinhapete eraldamiseks. See võimaldab teadlastel eraldada ja analüüsida üksikuid valke või nukleiinhappejärjestusi komplekssegus. Tüüpiline näide laboris olevast elektroforeesist on mikrobioloog, kes kasutab mikroobide koosluses toodetud DNA fragmentide eraldamiseks polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR). Sõltumata eesmärgist nõuab elektroforees alati puhverlahuse kasutamist.
TL; DR (liiga pikk; Ei lugenud)
Elektroforees eraldab makromolekulid nagu valk ja nukleiinhapped suuruse, laengu ja muude omaduste järgi. Elektroforeesiks, mis eraldub laenguga, kasutavad teadlased selle laengu geeli kaudu edastamiseks puhvrit. Samuti hoiab puhver geeli stabiilse pH tasemel, minimeerides muutused, mis võivad valgus või nukleiinhappes toimuda ebastabiilse pH taseme korral.
Elektroforeesi põhimõtted
Elektroforees eraldab molekulid gradiendi järgi nende suuruse, laengu või muude omaduste põhjal. See gradient võib olla elektriväli või denatureeriva gradientgeeli elektroforeesi (DGGE) korral denaturant, näiteks karbamiidi ja formamiidi segu. Valgud migreeruvad negatiivselt laetud anoodi ja positiivselt laetud katoodi suunas. Kuna suuremad molekulid rändavad aeglasemalt kui väiksemad, saavad teadlased mõõta läbitud vahemaad ja kasutada fragmentide suuruse määramiseks logaritme.
Denatureeriv gradientgeeli elektroforees
DGGE-ga liigub DNA mööda suureneva denatureerimisvõimsuse gradienti, kuni jõud on piisav selle konkreetse DNA-fragmendi täielikuks denatureerimiseks või lahtiharutamiseks. Sel hetkel ränne peatub. Teadlased saavad seda meetodit kasutada fragmentide eraldamiseks, lähtudes nende individuaalsest vastuvõtlikkusest denatureerimisele.
Mida puhver teeb
Laengu alusel eralduva elektroforeesi korral edastavad puhvris olevad ioonid eraldamiseks vajaliku laengu. Pakkides nõrga happe ja aluse reservuaari, hoiab puhver pH ka kitsas vahemikus. See on oluline, kuna valgu või nukleiinhappe struktuur ja laeng muutuvad, kui need mõjutavad olulisi pH-tasemeid, takistades seeläbi õiget eraldumist.
Tüüpilised puhvrid
Erinevad puhvrid sobivad ideaalselt elektroforeesigeeli hoidmiseks erinevatel soovitud pH-vahemikel. Teadlaste poolt sel eesmärgil kasutatud tüüpiliste puhvrite hulka kuuluvad äädikhape, boorhape, fosforhape ja sidrunhape, samuti glütsiin ja tauriin. Üldiselt peaks pKa väärtus (happe dissotsiatsioonikonstant) olema nõutava pH lähedal. Meile on eelistatav puhvreid, mille laadimissagedus on väike, et mitte juhtida liiga palju voolu.