Zellmembranen bestehen aus Phospholipiden und angelagerten oder eingebetteten Proteinen. Membranproteine spielen eine wichtige Rolle im Stoffwechsel und im Leben der Zelle. Mit der gewöhnlichen Mikroskopie können Sie Adhäsionsproteine, Transportproteine und Proteinkanäle in der Zellmembran nicht sichtbar machen oder charakterisieren. Unter Verwendung von Elektronenmikroskopie und einer Technik namens "Freeze Fracture", die gefrorene Zellmembranen aufspaltet, ermöglicht die Visualisierung der Membranstruktur und der Organisation von Proteinen im Meer von Phospholipide. Die Kombination anderer Methoden mit Gefrierfrakturierung hilft uns nicht nur, den Aufbau verschiedener Zellmembranen zu verstehen und Membranproteine, ermöglicht aber die Visualisierung und detaillierte Analyse der Funktion bestimmter Proteine, Bakterien und Viren.
Grundlegende Schritte bei Freeze Fracture
Mit flüssigem Stickstoff werden biologische Gewebeproben oder Zellen schnell eingefroren, um Zellbestandteile zu immobilisieren. Zellmembranen bestehen aus zwei Schichten von Phospholipiden, die als Doppelschicht bezeichnet werden, wobei die hydrophoben oder wasserabweisenden Lipidschwänze darauf zeigen die Innenseite der Membran und die hydrophilen oder wasserliebenden Enden des Lipidmoleküls zeigen nach außen und zur Innenseite der Membran Zelle. Die gefrorene Probe wird mit einem Mikrotom, einem messerähnlichen Instrument zum Schneiden dünner Gewebescheiben, geknackt oder gebrochen. Dadurch spaltet sich die Zellmembran genau zwischen den beiden Schichten auf, da die Anziehung zwischen den hydrophoben Lipidschwänzen die schwächste Stelle darstellt. Nach dem Brechen wird die Probe einem Vakuumverfahren unterzogen, das als "Gefrierätzen" bezeichnet wird. Die Oberfläche des gebrochenen Probe wird mit Kohlenstoff- und Platindampf beschattet, um eine stabile Nachbildung zu erhalten, die den Konturen des Bruchs folgt Flugzeug. Säure wird verwendet, um organisches Material zu verdauen, das an der Replika haftet, und hinterlässt eine dünne Platinhülle der zerbrochenen Membranoberfläche. Diese Hülle wird dann elektronenmikroskopisch analysiert.
Gefrierätzung
Gefrierätzen ist das Vakuumtrocknen einer unfixierten, gefrorenen und gefriergebrochenen biologischen Probe. Das Vakuumtrocknungsverfahren ähnelt dem Gefriertrocknen von Obst und Gemüse, das verpackt und in Lebensmittelgeschäften verkauft wird. Ohne Gefrierätzung werden viele Details der Zellstruktur durch Eiskristalle verdeckt. Der Tief- oder Gefrierätzschritt verbessert und erweitert die ursprüngliche Gefrierbruchmethode und ermöglicht die Beobachtung von Zellmembranen während verschiedener Aktivitäten. Es ermöglicht nicht nur die Analyse der Membranstruktur, sondern auch der intrazellulären Komponenten und liefert detaillierte Strukturinformationen zu Bakterien, Viren und großen zellulären Proteinen Komplexe.
Elektronenmikroskopie
Die Elektronenmikroskopie kann kleinste Organismen oder Strukturen wie Bakterien, Viren, intrazelluläre Komponenten und sogar Proteine mehr als millionenfach aufdecken und vergrößern. Zur Visualisierung wird eine ultradünne Probe mit einem Elektronenstrahl beschossen. Die beiden Methoden der Elektronenmikroskopie sind Rasterelektronenmikroskopie oder SEM und Transmissionselektronenmikroskopie oder TEM. Gefrierbruchproben werden routinemäßig mit TEM analysiert. TEM hat eine bessere Auflösung als SEM und bietet Strukturinformationen von bis zu 3 Nanometern von Replikaten.
Aufdecken der Zellmembranstruktur
Die Entwicklung und Anwendung der Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie zeigte, dass Zellplasmamembranen aus Lipiddoppelschichten bestehen und verdeutlichte, wie Proteine in Zellmembranen organisiert sind. Gefrierbruch bietet einen einzigartigen Blick auf das Innere von Zellmembranen, da er Membranphospholipide aufspaltet und in zwei gegenüberliegende und komplementäre Schichten oder Flächen trennt. In den mehr als 50 Jahren seit der Einführung der ersten Gefrierbruchmaschine ist die Herstellung einer Platinreplik immer noch die einzige Möglichkeit, strukturelle Informationen über die Zellmembran zu erhalten. Die Technik zeigt, ob bestimmte Proteine schwimmen oder in der Zellmembran verankert sind und ob und wie einige Proteine aggregieren. Eine neuere Methode – mit Antikörpern, die auf bestimmte Proteine abzielen – wird mit Gefrierbruch kombiniert, um Proteine und ihre Funktion in der Zellmembran zu identifizieren.