DNA
Desoxyribonukleinsäure und Proteine. DNA ist in Einheiten organisiert, die Gene genannt werden, von denen jede für eine bestimmte RNA- oder Proteinsequenz kodiert. Gene werden untersucht, um mehr über biologische Struktur und Funktion, Evolution, Krankheit und viele andere Aspekte lebender Systeme zu erfahren. Um Gene im Detail zu untersuchen, muss DNA aus interessierenden Zellen isoliert und gereinigt werden.
DNA-Extraktion
Obwohl DNA aus einer einzelnen Zelle extrahiert und untersucht werden kann, reicht es nicht aus, sie mit bloßem Auge zu sehen. Um eine ausreichende Menge zum Spoolen zu erhalten, gilt: Je mehr Zellen Sie bearbeiten müssen, desto besser (viele Millionen).
Die genauen Protokolle variieren erheblich, um den einzigartigen Eigenschaften spezifischer Proben Rechnung zu tragen, aber die allgemeinen Schritte sind Homogenisierung, Lyse, Verdauung, Trennung und Sammlung. Das Verfahren wird am besten in einem kleinen (je nach Probengröße) Glas- oder Kunststoffröhrchen durchgeführt.
Eine Probe wird im Allgemeinen gemischt oder zermahlen, um die Zellen gründlich voneinander zu trennen. Dadurch werden die Zellinhaltsstoffe für die nachfolgenden Reagenzien besser zugänglich. Dem Homogenisat werden dann Detergenzien oder Enzyme zugesetzt, um die Zellmembranen (und Kernmembranen, wenn die Zellen eukaryontisch sind) zu lysieren, um die DNA freizusetzen. Zu diesem Zeitpunkt ist die DNA von Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten und allem anderen, was in den Zellen enthalten war, umgeben.
Ein weiterer enzymatischer Verdau kann notwendig sein, um Proteine abzubauen, damit sie nicht an DNA binden und deren Sammlung stören. Die DNA wird vom restlichen Zellinhalt durch Zugabe von kaltem, reinem Ethyl- oder Isopropylalkohol getrennt. DNA ist in diesen Alkoholen nicht löslich, daher kondensiert sie, um den Kontakt mit dem Alkohol zu minimieren. Die kondensierte DNA wird dann gesammelt, üblicherweise durch Zentrifugation oder Aufspulen.
DNA-Spooling
Die DNA-Sammlung durch Aufspulen ist effektiv, wenn eine große DNA-Menge aus einem Extraktionsverfahren gewonnen wird. Es ist auch eine ausgezeichnete Demonstrationsmethode, da ein beeindruckendes Knäuel reiner DNA deutlich sichtbar ist.
Um DNA zu spoolen, muss der Trennschritt sorgfältig durchgeführt werden. Wenn es nicht Teil des zuvor zugegebenen Lysereagenzgemisches war, muss der Lösung vor dem Schritt der Alkoholzugabe eine konzentrierte Salzlösung (Natriumchlorid) zugesetzt werden. Der kalte Alkohol wird langsam an der Seite des Reagenzglases heruntergegossen, um eine Schicht auf der wässrigen Lösung zu bilden, wobei ein Mischen vermieden wird. Wenn es richtig gemacht wird, bildet der Alkohol eine eigene Schicht auf der salzigen Schicht. Dann kommt das Spulen.
Um die DNA aus der Salzschicht zu sammeln, führen Sie einen Glasrührstab vorsichtig durch die Alkoholschicht, bis er den Boden des Röhrchens berührt. Drehen Sie den Stab langsam zwischen den Fingern, während Sie die Grenzfläche zwischen den beiden Schichten beobachten. Wenn genügend DNA vorhanden ist, verklumpt sie an der Grenzfläche zwischen den Schichten, um eine milchige durchscheinende Masse zu bilden. Drehen Sie den Stab, um die DNA um ihn zu wickeln (das ist der Spulenteil) und ziehen Sie ihn aus dem Röhrchen. Die DNA kann zur Aufbewahrung oder weiteren Analyse in ein anderes Röhrchen mit reinem Alkohol überführt werden.