DNA-Klonierung: Definition, Prozess, Beispiele

Es ist möglich, ganze Organismen wie das Schaf Dolly zu klonen, aber das Klonen von DNA ist anders. Es verwendet molekularbiologische Techniken, um identische Kopien von DNA-Sequenzen oder einzelnen Genen.

Mit gentechnischen Methoden werden Abschnitte des genetischen Codes der DNA identifiziert und isoliert. Das Klonen der DNA kopiert dann die Nukleinsäure Sequenzen in den Segmenten.

Die resultierenden identischen Kopien können für weitere Forschungen oder für biotechnologische Anwendungen verwendet werden. Oft kodiert das kopierte Gen ein Protein, das Teil medizinischer Behandlungen sein kann. DNA-Technologie einschließlich DNA-Klonierung unterstützt das Verständnis, wie Gene funktionieren und wie der genetische Code des Menschen die Funktion des Körpers beeinflusst.

Das Klonen von DNA ist der molekularbiologische Prozess, bei dem identische Kopien von DNA-Segmenten hergestellt werden, die sich in den Chromosomen befinden, die den genetischen Code fortgeschrittener Organismen enthalten.

Der Prozess erzeugt große Mengen der Ziel-DNA-Sequenzen. Das Ziel der DNA-Klonierung besteht darin, die Ziel-DNA-Sequenzen selbst oder die in den Zielsequenzen kodierten Proteine ​​herzustellen.

Die beiden Methoden, die beim Klonen von DNA verwendet werden, heißen Plasmidvektor und Polymerase-Kettenreaktion (PCR). In dem Plasmidvektor Methode werden DNA-Stränge geschnitten mit Restriktionsenzyme DNA-Fragmente zu produzieren, und die resultierenden Segmente werden zur weiteren Vervielfältigung in Klonierungsvektoren eingefügt, die als Plasmide bezeichnet werden. Die Plasmide werden in Bakterienzellen eingebracht, die dann die DNA-Kopien oder kodierten Proteine ​​herstellen.

In dem PCR-Methode, wird das zu duplizierende Segment der DNA-Stränge mit Enzymen markiert, die als bezeichnet werden Grundierungen. Ein Polymerase-Enzym erstellt Kopien des markierten Teils des DNA-Strangs. Diese Methode verwendet keine Restriktionsenzyme und kann klonierte DNA aus kleinen Proben herstellen. Manchmal werden die beiden DNA-Technologiemethoden zusammen verwendet, um die besten Eigenschaften von jedem in eine Gesamtreaktion zu integrieren.

Der Vektor des Verfahrens bezieht sich auf das Plasmid, das verwendet wird, um das zu klonierende Ziel-DNA-Segment zu halten. Plasmide sind kleine kreisförmige Stränge von nicht-chromosomale DNA findet sich in vielen Organismen, einschließlich Bakterien und Viren.

Bakterielle Plasmide sind der Vektor, der zum Einfügen des Ziel-DNA-Segments in Bakterienzellen zur weiteren Vervielfältigung verwendet wird.

Auswahl und Isolierung der Ziel-DNA: Bevor der DNA-Klonierungsprozess beginnen kann, müssen die DNA-Sequenzen identifiziert werden, insbesondere die Anfänge und die Enden der DNA-Abschnitte.

Solche DNA-Sequenzen können gefunden werden, indem vorhandene klonierte DNA mit bekannten Sequenzen verwendet oder das von der Ziel-DNA-Sequenz produzierte Protein untersucht wird. Sobald die Sequenz bekannt ist, können die entsprechenden Restriktionsenzyme verwendet werden.

Schneiden der Ziel-DNA mit Restriktionsenzymen: Restriktionsenzyme werden ausgewählt, um nach dem DNA-Code am Anfang und Ende der Zielsequenzen zu suchen.

Wenn die Restriktionsenzyme eine spezielle kodierte Sequenz von Basenpaaren finden, die als Restriktionsstellen bezeichnet werden, heften sich an dieser Stelle an die DNA und winden sich um das DNA-Molekül, wodurch die Strand. Die geschnittenen DNA-Segmente, die die Zielsequenz enthalten, stehen nun für die Duplikation zur Verfügung.

Auswahl des Plasmidvektors und Insertion der Ziel-DNA: Ein geeignetes Plasmid enthält idealerweise die gleichen DNA-kodierenden Sequenzen wie der DNA-Strang, aus dem die Ziel-DNA geschnitten wurde. Der zirkuläre DNA-Strang des Plasmids wird mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten, die zum Schneiden der Ziel-DNA verwendet wurden.

EIN DNA-Ligase-Enzym wird verwendet, um die DNA-Segment-Verknüpfung zu fördern, und die Enden des Ziel-DNA-Segments verbinden sich mit den geschnittenen Enden der Plasmid-DNA. Die Ziel-DNA bildet nun einen Teil des zirkulären Plasmid-DNA-Strangs.

Einbringen des Plasmids in eine Bakterienzelle: Sobald das Plasmid die zu klonierende DNA-Sequenz enthält, kann die eigentliche Klonierung mit einem Verfahren namens place erfolgen bakterielle Transformation. Die Plasmide werden in eine Bakterienzelle wie E. coli, und die Zellen mit den neuen DNA-Abschnitten produzieren Kopien und die entsprechenden Proteine.

Bei der bakteriellen Transformation werden die Wirtszellen und die Plasmide zusammen etwa 12 Stunden bei Körpertemperatur inkubiert. Die Zellen nehmen einen Teil der Plasmide auf und behandeln sie als ihre eigene Plasmid-DNA.

Ernte der geklonten DNA und Proteine: Die meisten für die DNA-Klonierung verwendeten Plasmide haben Antibiotikaresistenzgene in ihre DNA eingebaut. Wenn die Bakterienzellen die neuen Plasmide aufnehmen, werden sie resistent gegen Antibiotika.

Wird die Kultur mit Antibiotika behandelt, überleben nur die Zellen, die die neuen Plasmide aufgenommen haben. Das Ergebnis ist eine Reinkultur von Bakterienzellen mit geklonter DNA. Diese DNA kann dann geerntet oder das entsprechende Protein hergestellt werden.

Das PCR Methode ist einfacher und kopiert vorhandene DNA an Ort und Stelle. Es erfordert kein Schneiden mit Restriktionsenzymen oder Einfügen PlasmidDNA Sequenzen. Dadurch eignet es sich besonders zum Klonen von DNA-Proben mit einer begrenzten Anzahl von DNA-Strängen. Während die Methode DNA klonieren kann, kann sie nicht für die Produktion des entsprechenden Proteins verwendet werden.

Entwickeln der DNA-Stränge: DNA in Chromosomen ist eng in einer Doppelhelixstruktur gewunden. Erhitzen der DNA auf 96 Grad Celsius in einem Prozess namens Denaturierung lässt das DNA-Molekül entrollen und in zwei Stränge trennen. Diese Trennung ist erforderlich, da nur ein einzelner DNA-Strang auf einmal kloniert werden kann.

Auswahl der Primer: Wie bei der Klonierung von Plasmidvektor-DNA müssen die zu klonierenden DNA-Sequenzen unter besonderer Berücksichtigung der Anfänge und Enden der DNA-Abschnitte identifiziert werden. Primer sind Enzyme, die an spezifische DNA-Codesequenzen binden, und sie müssen ausgewählt werden, um die Ziel-DNA-Segmente zu markieren. Die richtigen Primer heften sich an die DNA-Molekülsequenzen, um die Anfänge und Enden der Zielsegmente zu markieren.

Annealing der Reaktion, um die Primer zu binden: Das Abkühlen der Reaktion auf etwa 55 Grad Celsius nennt man Glühen. Wenn die Reaktion abkühlt, werden die Primer aktiviert und heften sich an den DNA-Strang an jedem Ende eines Ziel-DNA-Segments. Die Primer fungieren nur als Marker und der DNA-Strang muss nicht geschnitten werden.

Herstellung identischer Kopien des Ziel-DNA-Segments: In einem Prozess namens Erweiterung, wird das wärmeempfindliche TAQ-Polymerase-Enzym der Reaktion zugesetzt. Die Reaktion wird dann auf 72 Grad Celsius erhitzt, wodurch das Enzym aktiviert wird. Das aktive DNA-Polymerase-Enzym bindet an die Primer und kopiert die DNA-Sequenz zwischen ihnen. Der anfängliche DNA-Sequenzierungs- und Klonierungsprozess ist abgeschlossen.

Steigerung der Ausbeute an klonierter DNA: Der anfängliche Annealing- und Verlängerungsprozess erzeugt relativ wenige Kopien der verfügbaren DNA-Strangsegmente. Um die Ausbeute durch zusätzliche DNA-Replikation zu erhöhen, wird die Reaktion erneut gekühlt, um die Primer zu reaktivieren und sie an andere DNA-Stränge binden zu lassen.

Dann aktiviert das erneute Erhitzen der Reaktion das Polymerase-Enzym wieder und es werden mehr Kopien hergestellt. Dieser Zyklus kann 25 bis 30 Mal wiederholt werden.

Das Plasmidvektorverfahren beruht auf einer ausreichenden anfänglichen Zufuhr von DNA zum Schneiden und Einfügen in Plasmide. Zu wenig ursprüngliche DNA führt zu weniger Plasmiden und zu einem langsamen Start der klonierten DNA-Produktion.

Das PCR-Verfahren kann aus wenigen ursprünglichen DNA-Strängen eine große Menge DNA herstellen, aber da die DNA nicht in eine Bakterienzelle implantiert wird, ist eine Proteinproduktion nicht möglich.

Um das Protein, das in den zu klonierenden DNA-Fragmenten kodiert ist, aus einer kleinen anfänglichen DNA-Probe herzustellen, können die beiden Methoden zusammen verwendet werden, und sie können ergänzen. Zuerst wird die PCR-Methode verwendet, um DNA aus einer kleinen Probe zu klonen und viele Kopien herzustellen.

Dann werden die PCR-Produkte mit der Plasmidvektormethode verwendet, um die produzierte DNA in Bakterienzellen zu implantieren, die das gewünschte Protein produzieren.

Die Molekularbiologie verwendet das Klonen von Genen und die DNA-Replikation für medizinische und kommerzielle Zwecke. Die Bakterien mit geklonten DNA-Sequenzen werden verwendet, um Medikamente herzustellen und Substanzen zu ersetzen, die Menschen mit genetischen Störungen nicht selbst herstellen können.

Typische Anwendungen sind:

• Das Gen für Humaninsulin wird in Bakterien kloniert, die dann das von Diabetikern verwendete Insulin produzieren.
• Gewebe-Plasminogen-Aktivator wird aus geklonter DNA hergestellt und verwendet, um zu helfen Blutgerinnsel verhindern.
• Menschliches Wachstumshormon produziert und an Menschen verabreicht werden, die es nicht selbst herstellen können.

Die Biotechnologie nutzt das Klonen von Genen auch in der Landwirtschaft, um neue Eigenschaften bei Pflanzen und Tieren zu erzeugen oder bestehende Eigenschaften zu verbessern. Mit zunehmender Klonierung von Genen steigt die Zahl der möglichen Verwendungen exponentiell.

DNA-Moleküle machen einen kleinen Teil des Materials einer lebenden Zelle aus, und es ist schwierig, die Einflüsse der vielen Gene zu isolieren. Die DNA-Klonierungsmethoden liefern große Mengen einer bestimmten DNA-Sequenz zum Studium, und die DNA produziert Proteine ​​genau wie in der ursprünglichen Zelle. Das Klonen von DNA ermöglicht es, diesen Vorgang für verschiedene Gene isoliert zu untersuchen.

Typische Anwendungen für Forschung und DNA-Technologie umfassen die Untersuchung von:

• Funktion eines Gens.
• Mutationen eines Gens.
• Genexpression.
• Genprodukte.
• Genetische Defekte.

Wenn mehr DNA-Sequenzen kloniert werden, ist es einfacher, zusätzliche Sequenzen zu finden und zu klonen. Anhand der vorhandenen klonierten DNA-Segmente kann festgestellt werden, ob ein neues Segment mit dem alten übereinstimmt und welche Teile sich unterscheiden. Die Identifizierung einer Ziel-DNA-Sequenz ist dann schneller und genauer.

Im Gentherapie, wird ein geklontes Gen den Zellen eines Organismus präsentiert, dessen natürliches Gen beschädigt ist. Ein lebenswichtiges Gen, das ein für eine bestimmte Funktion des Organismus benötigtes Protein produziert, könnte mutiert, durch Strahlung verändert oder durch Viren beeinflusst werden.

Wenn das Gen nicht richtig funktioniert, fehlt der Zelle eine wichtige Substanz. Gentherapie versucht tries Ersetzen Sie das Gen durch eine geklonte Version, die die erforderliche Substanz produziert.

Die Gentherapie ist noch experimentell, und nur wenige Patienten wurden mit der Technik geheilt. Die Probleme liegen darin, das einzelne Gen zu identifizieren, das für eine Krankheit verantwortlich ist, und viele Kopien des Gens an die richtigen Zellen zu liefern. Mit zunehmender Verbreitung der DNA-Klonierung wurde die Gentherapie in mehreren spezifischen Situationen angewendet.

Zu den letzten erfolgreichen Bewerbungen gehörten:

• Parkinson-Krankheit: Unter Verwendung eines Virus als Vektor wurde ein mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang stehendes Gen in das Mittelhirn von Patienten injiziert. Die Patienten erlebten verbesserte motorische Fähigkeiten ohne nachteilige Nebenwirkungen.
• Adenosindeaminase (ADA)-Mangel: Eine genetische Immunstörung wurde behandelt, indem den Patienten Blutstammzellen entnommen und das ADA-Gen eingefügt wurde. Dadurch konnten die Patienten zumindest einen Teil ihrer eigenen ADA herstellen.
• Hämophilie: Menschen mit Hämophilie produzieren keine spezifischen Proteine, die die Blutgerinnung unterstützen. In Leberzellen von Patienten wurde ein Gen zur Produktion eines der fehlenden Proteine ​​eingebaut. Die Patienten produzierten das Protein und Blutungen wurden reduziert.

Die Gentherapie ist eine der vielversprechendsten Anwendungen der DNA-Klonierung, aber andere neue Anwendungen werden wahrscheinlich zunehmen, wenn mehr DNA-Sequenzen untersucht und ihre Funktion bestimmt werden. Das Klonen von DNA liefert den Rohstoff für die Gentechnik in den benötigten Mengen.

Wenn die Rolle der Gene bekannt ist und ihre ordnungsgemäße Funktion durch den Austausch defekter Gene, viele chronische Krankheiten und sogar Krebs können mit DNA auf genetischer Ebene angegriffen und behandelt werden Technologie.

Zugehöriger Inhalt:

• Kolonieeigenschaften von E.Coli (Escherichia Coli)
• RNA: Definition, Funktion, Struktur