Gelelektrophorese ist eine häufig verwendete Labortechnik mit vielen praktischen Anwendungen, einschließlich DNA-Fingerprinting und Genomsequenzierung. Der Prozess beinhaltet die Trennung DNA Fragmente unter Verwendung eines elektrischen Stroms, während die Geschwindigkeit der Molekülbewegung durch ein Filtergel verfolgt wird.
Durch Hinzufügen von blauem oder orangefarbenem Tracking-Farbstoff zu farblosen DNA-Proben können Sie Ihre Probe sehen und Informationen darüber erhalten, wie sich DNA-Moleküle während der Elektrophorese bewegen. Die Identifizierung basiert auf der Größe der DNA-Banden auf dem Gel nach der Migration von Molekülen.
So funktioniert die Gelelektrophorese
Gelelektrophorese zieht DNA-Fragmente mit elektrischem Strom durch ein Gel, um DNA-Moleküle nach Größe und elektrischer Ladung zu isolieren und zu identifizieren. Das Gel wird oft mit Agarose-Pulver — ein Polysaccharid, das aus. extrahiert wurde Seetang.
Agarose wird zu einer Pufferlösung aus Wasser und Salz gegeben, und die Mischung wird erhitzt und abgekühlt, um ein poröses Gel herzustellen, das während des Elektrophoreseverfahrens als Filtermatrix wirkt. Das Gel wird dann in eine Elektrophorese-Einheit gegeben und mit Pufferlösung bedeckt, die
Elektrizität.Lösungen, die DNA und Ladefarbstoffe enthalten, werden in kleine Vertiefungen im Gel pipettiert, die während der Gelvorbereitung hergestellt werden müssen. Farbstoffedir helfenSehen Sie deutlich die Probe die Sie den Gel-Wells in der Nähe der negativen Elektrode des Elektrophoresegeräts hinzufügen.
Am gegenüberliegenden Ende befindet sich eine positive Elektrode. Ein bekannter Standard von DNA-Fragmenten wird in die erste Vertiefung gegeben, wodurch eine Leiter von DNA-Banden zu Vergleichs- und Identifizierungszwecken erzeugt wird.
Das Phosphat-Rückgrat von DNA-Molekülen verleiht der DNA eine negative Ladung. Gegensätze ziehen sich an, folglich werden DNA-Moleküle von der positiven Elektrode angezogen und beginnen sich zu bewegen oder zu „wandern“, wenn ein elektrischer Strom eingeschaltet wird.
Kleinere DNA-Fragmente reisen schneller als größere Fragmente, da sie auf weniger Widerstand stoßen, wenn sie durch die poröse Matrix des Gels wandern. DNA-Fragmente ähnlicher Größe bilden im Gel DNA-Banden.
Zweck und Bedeutung des Ladens von Farbstoffen
DNA ist farblos, also hinzufügen Tracking-Farben zu einer probe hilft dir Bestimmen Sie die Bewegungsgeschwindigkeit von Proteinmolekülen unterschiedlicher Größe im Gel während der Elektrophorese. Beispiele für das Laden von Farbstoffen, die sich mit der DNA-Probe bewegen, umfassen BromphenolBlau und Xylolcyanol.
Der gewählte Farbstoff sollte nicht reaktiv sein oder die DNA verändern. Bromphenolblau ist ein Farbstoff, der verwendet wird, um kleinere DNA-Stränge mit etwa 400 Basenpaaren zu verfolgen, während Xylolcyanol für größere DNA-Stränge mit bis zu 8.000 Basenpaaren besser geeignet ist. Der gewählte Farbstoff sollte nicht reaktiv sein oder die DNA verändern.
Rolle von Glycerin bei der Agarose-Gelelektrophorese
Bei der Vorbereitung Ihrer DNA-Probe für Elektrophorese, müssen Sie Glycerin und Wasser zusammen mit den Farbstoffen hinzufügen. Glycerin ist eine schwere, sirupartige Substanz, die der DNA-Probe mehr Dichte verleiht, bevor sie in die Vertiefungen an einem Ende des Gelblatts eingeführt wird.
Ohne Glycerin würde sich die DNA-Probe verteilen, anstatt zu sinken und eine Schicht im Brunnen zu bilden, wie es bei einer DNA-Leiter der Fall sein soll.
Tracking-Farbstoff in SDB-SEITE
Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS PAGE) ist eine Technik, die sich zur Trennung von Proteinen und Aminosäuren eignet, die kleiner und komplexer als lineare DNA-Moleküle sind. Für die Elektrophorese wird Polyacrylamid (SDS PAGE Gel) anstelle von Agarosegel verwendet.
Bromphenolblau (BPB) wird dem Probenpuffer als Tracking-Farbstoff die sich in die gleiche Richtung bewegt, um Proteine zu trennen und ihre Vorderkante abzugrenzen.
Rolle des DNA-bindenden Farbstoffs
DNA-bindender Farbstoff wie orangefarben Ethidiumbromid kann dem Gel oder dem Elektrophoresepuffer zugesetzt werden. Wie der Name schon sagt, bindet der Farbstoff an das DNA-Molekül.
Beim Umgang mit diesem mutagenen Farbstoff ist große Vorsicht geboten, da er an DNA in Hautzellen binden kann. Im Gegensatz zu Tracking-Farbstoffen ist Ethidiumbromid fluoresziert hell unter UV-Licht, wodurch die DNA-Banden sichtbar werden.