Das molekulare Klonen ist eine gängige biotechnologische Methode, mit der jeder Studierende und Forscher vertraut sein sollte. Molekulares Klonen unter Verwendung eines Enzymtyps, der als Restriktionsenzym bezeichnet wird, um menschliche DNA in Fragmente zu zerschneiden, die dann in die Plasmid-DNA einer Bakterienzelle eingefügt werden können. Restriktionsenzyme halbieren doppelsträngige DNA. Je nach Restriktionsenzym kann der Schnitt entweder zu einem klebrigen oder einem stumpfen Ende führen. Sticky Ends sind beim molekularen Klonen nützlicher, da sie sicherstellen, dass das menschliche DNA-Fragment in der richtigen Richtung in das Plasmid eingefügt wird. Der Ligationsvorgang oder die Fusion von DNA-Fragmenten erfordert weniger DNA, wenn die DNA klebrige Enden hat. Schließlich können mehrere Restriktionsenzyme mit klebrigem Ende dasselbe klebrige Ende produzieren, obwohl jedes Enzym eine andere Restriktionssequenz erkennt. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass Ihre interessierende DNA-Region durch klebrige Endenzyme herausgeschnitten werden kann.
Restriktionsenzyme und Restriktionsstellen
Restriktionsenzyme sind Enzyme, die spezifische Sequenzen auf doppelsträngiger DNA erkennen und die DNA an dieser Sequenz halbieren. Die erkannte Sequenz wird als Restriktionsstelle bezeichnet. Restriktionsenzyme werden Endonukleasen genannt, weil sie doppelsträngige DNA, wie DNA normalerweise existiert, an Stellen zwischen den Enden der DNA schneiden. Es gibt mehr als 90 verschiedene Restriktionsenzyme. Jeder erkennt eine unterschiedliche Restriktionsstelle. Restriktionsenzyme spalten ihre jeweiligen Restriktionsstellen 5000-mal effizienter als andere Stellen, die sie nicht erkennen.
Die richtige Orientierung
Restriktionsenzyme kommen in zwei allgemeine Klassen. Sie schneiden DNA entweder in klebrige Enden oder stumpfe Enden. Ein klebriges Ende hat einen kurzen Bereich von Nukleotiden, den Bausteinen der DNA, die ungepaart sind. Diese ungepaarte Region wird als Überhang bezeichnet. Der Überhang wird als klebrig bezeichnet, weil er sich mit einem anderen klebrigen Ende paaren möchte und wird, das eine komplementäre Überhangsequenz hat. Klebrige Enden sind wie lange verlorene Zwillinge, die sich fest umarmen wollen, sobald sie sich treffen. Auf der anderen Seite sind stumpfe Enden nicht klebrig, da alle Nukleotide bereits zwischen den beiden DNA-Strängen gepaart sind. Sticky Ends haben den Vorteil, dass ein Fragment menschlicher DNA nur in einer Richtung in ein bakterielles Plasmid passen kann. Wenn dagegen sowohl die menschliche DNA als auch das bakterielle Plasmid stumpfe Enden aufweisen, kann die menschliche DNA Kopf-an-Schwanz oder Schwanz-an-Kopf in das Plasmid eingefügt werden.
Das Ligieren von klebrigen Enden erfordert weniger DNA
Obwohl DNA mit Stäbchenenden aufgrund ihrer „Klebrigkeit“ leichter zueinander zu finden ist, können weder klebrige Enden noch stumpfe Enden zu einem zusammenhängenden Stück DNA verschmelzen. Die Bildung eines kontinuierlichen DNA-Stücks, das vollständig verknüpft ist, erfordert ein Enzym namens Ligase. Ligasen verbinden die Rückgrate von Nukleotiden an den klebrigen oder stumpfen Enden, was zu einer kontinuierlichen Kette von Nukleotiden führt. Da klebrige Enden aufgrund ihrer gegenseitigen Anziehungskraft schneller zueinander finden, benötigt der Ligationsprozess weniger menschliche DNA und weniger Plasmid-DNA. Die glatten Enden von DNA und Plasmiden finden sich weniger wahrscheinlich, und daher erfordert die Ligation von glatten Enden, dass mehr DNA in das Reagenzglas gegeben wird.
Verschiedene Enzyme können das gleiche klebrige Ende geben
Restriktionsstellen befinden sich im gesamten Genom von Organismen, sind jedoch nicht gleichmäßig verteilt. In Plasmiden können sie so konstruiert werden, dass sie direkt nebeneinander liegen. Wissenschaftler, die ein Fragment menschlicher DNA aus dem menschlichen Genom herausschneiden wollen, müssen Restriktionsstellen finden, die sich vor und hinter der Region des Fragments befinden. Abgesehen davon, dass ein DNA-Fragment in die richtige Richtung eingefügt wird, können verschiedene Sticky-End-Enzyme dasselbe Sticky-Ende erzeugen, obwohl sie unterschiedliche Restriktionssequenzen erkennen. BamHI, BglII und Sau3A haben beispielsweise unterschiedliche Erkennungssequenzen, produzieren aber das gleiche klebrige GATC-Ende. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass es Restriktionsstellen für klebrige Enden gibt, die Ihr interessierendes menschliches Gen flankieren.
