Western Blotting ist eines der am häufigsten verwendeten Verfahren in biochemischen Labors. Grundsätzlich werden Proteine aus einer Probe nach Größe getrennt und dann mit Antikörpern getestet, um festzustellen, ob ein bestimmtes Protein vorhanden ist. Es ist nicht nur in der Forschung nützlich, sondern auch in medizinischen oder diagnostischen Labors; Tests auf HIV und Lyme-Borreliose umfassen beispielsweise einen ELISA-Test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), gefolgt von einem Western Blot, wenn der ELISA positiv ist. Trotz seiner Popularität hat Western Blotting jedoch mehrere Nachteile.
Nichtquantitativ
Klassische Western-Blots sind nicht quantitativ. Mit anderen Worten, sie können den Forschern zwar sagen, ob ein bestimmtes Protein vorhanden ist, aber sie ermöglichen es nicht, zu quantifizieren, wie viel von dem Protein vorhanden ist. Einige Biotech-Unternehmen verkaufen jetzt Kits, mit denen Forscher oder Labortechniker die Menge an Protein anhand einer Standardkurve vorhanden -- dies funktioniert jedoch nur, wenn reine Proben des gleichen Proteins vorliegen verfügbar. Außerdem kann das Molekulargewicht eines Proteins nur mit Western-Blotting abgeschätzt und nicht wie mit Massenspektrometrie genau bestimmt werden.
Antikörper
Ein Western Blot kann nur durchgeführt werden, wenn primäre Antikörper gegen das interessierende Protein verfügbar sind. Obwohl Antikörper für viele verschiedene Proteine von Biotech-Unternehmen erhältlich sind, sind sie nicht billig; Wenn für ein bestimmtes Protein keine Primärantikörper verfügbar sind, ist es nicht möglich, einen Western-Blot zur Suche nach diesem bestimmten Protein durchzuführen. Darüber hinaus möchten Forscher möglicherweise feststellen, ob ein Protein in irgendeiner Weise modifiziert wurde - ob es phosphoryliert wurde (hatte eine daran gebundene Phosphatgruppe) zum Beispiel -- und bei der Western-Blot-Technik benötigen sie Antikörper, die spezifisch für die modifizierte Protein.
Ausbildung
Es kann eine Herausforderung sein, einen Western Blot richtig durchzuführen und gute Ergebnisse zu erzielen, daher muss das Personal gut geschult sein. In diesem wie in vielen anderen Fällen ist Erfahrung vielleicht der beste Lehrmeister; selbst für einen erfahrenen Techniker ist ein Western Blot jedoch zeitaufwändig. Der Gelelektrophorese-Teil des Experiments wird beispielsweise typischerweise eine bis zwei Stunden dauern. Natürlich können auch andere Aufgaben durchgeführt werden, während das Gel läuft, aber das Experiment braucht noch einige Zeit, um Ergebnisse zu erhalten.
Andere Einschränkungen
Antikörper können manchmal eine gewisse Off-Target-Bindung aufweisen, was zu schlechteren Ergebnissen führen kann. Darüber hinaus verwenden Sie beim Western Blotting einen Antikörper gegen ein bestimmtes Protein, sodass Ihre Ergebnisse Ihnen nur sagen, ob dieses Protein vorhanden war. Die hochauflösende Massenspektrometrie hingegen zeigt alle in einer Probe vorhandenen Proteine und ist im Gegensatz zum klassischen Western-Blotting quantitativ. Es ist natürlich wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Massenspektrometrie im Vergleich zum Western-Blotting viel teurer und auch technisch anspruchsvoller in der Anwendung ist.