Die Spektrophotometrie ist ein unschätzbares Werkzeug in Chemie und Biologie. Die Grundidee ist einfach: Verschiedene Stoffe absorbieren Licht/elektromagnetische Strahlung bei manchen Wellenlängen besser als bei anderen. Deshalb sind einige Materialien transparent, andere beispielsweise farbig. Wenn Sie eine Lösung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge durchstrahlen, wird umso mehr Licht absorbiert, je höher ihre Konzentration ist. Um die Konzentration zu berechnen, müssen Sie Ihren Messwert mit den Messwerten für Standards bekannter Konzentration vergleichen. Das folgende Verfahren ist ein ziemlich allgemeines Verfahren, das für ein Chemielehrlabor geschrieben wurde, aber es kann auch für andere Einstellungen modifiziert werden.
Ziehen Sie wie immer bei der Arbeit im Labor zu Ihrer eigenen Sicherheit Schutzbrille, Handschuhe und einen langärmeligen Mantel an.
Drücken Sie die Gummikugel zusammen, um die Luft zu entleeren, legen Sie sie dann auf Ihre Messpipette und lassen Sie die Kugel sich entspannen, damit sie Wasser in die Pipette saugt. Als nächstes entfernen Sie die Glühbirne und verschließen Sie die Spitze der Pipette mit Ihrem Finger; Dadurch wird die Pipette versiegelt, sodass die darin befindliche Lösung nicht herausfließt, bis Ihr Finger entfernt wird. Heben Sie die Fingerkante leicht an, um ein wenig Lösung aus der Pipette fließen zu lassen, bis Sie das gewünschte Volumen erreicht haben. Üben Sie mit etwas Wasser und einem Becherglas, um ein Gefühl dafür zu bekommen, wie die Messpipette funktioniert. Der Link im Abschnitt Ressourcen enthält einen Filmclip, der Ihnen zeigt, wie Sie eine Pipette verwenden, falls Sie noch nie mit einer Pipette gearbeitet haben.
Beschriften Sie 5 Reagenzgläser als Standards 1-5. Sie können sie mit Kreppband und einem Stift oder mit einem trocken abwischbaren Marker beschriften.
Wählen Sie fünf Konzentrationen für Ihre Standards. Sie möchten, dass die Standardkonzentrationen etwa im gleichen Intervall voneinander getrennt sind – z. B. 0,1 molar, 0,2 molar, 0,3 molar usw. -- und ungefähr im gleichen Bereich, wie Sie erwarten, dass Ihre Unbekannte sein wird. Verwenden Sie vorerst die folgenden fünf Konzentrationen, aber denken Sie daran, dass Sie diese ändern müssen, wenn Sie Ihr eigenes Experiment durchführen:
Standard 1: 0,1 molar Standard 2: 0,2 molar Standard 3: 0,3 molar Standard 4: 0,4 molar Standard 5: 0,5 molar
Als nächstes nehmen Sie die 1 molare Standardlösung und geben die folgenden Mengen in die Reagenzgläser 1-5. Denken Sie daran, dass diese Mengen anhand der oben aufgeführten Konzentrationen berechnet werden, sodass Sie sie möglicherweise bei der Durchführung Ihres eigenen Experiments ändern müssen.
Standard 1: 0,8 Milliliter Standard 2: 1,6 Milliliter Standard 3: 2,4 Milliliter Standard 4: 3,2 Milliliter Standard 5: 4 Milliliter
Spülen Sie die Messpipette und übertragen Sie dann die folgenden Mengen an entionisiertem Wasser:
Standard 1: 7,2 Milliliter Standard 2: 6,4 Milliliter Standard 3: 5,6 Milliliter Standard 4: 4,8 Milliliter Standard 5: 4,0 Milliliter
Grundsätzlich besteht die Idee darin, die Lösungsmenge in jedem Röhrchen auf bis zu 8 Milliliter zu bringen.
Verschließen Sie jedes der Standardröhrchen mit Parafilm und drehen Sie sie zum Mischen um.
Markieren Sie weitere fünf Reagenzgläser als "Unbekannt 1-5". Fügen Sie jeweils die gleichen Mengen Ihrer unbekannten oder Testlösung hinzu, die Sie mit der 1 molaren Lösung für die Standards verwendet haben. Mit anderen Worten: Unbekannt 1 enthält 0,8 Milliliter Testlösung und 7,2 Milliliter Wasser, unbekannt 2 enthält 1,6 Milliliter Testlösung und 6,4 Milliliter Wasser, und so her.
Bedecken Sie jede der Unbekannten mit Parafilm und drehen Sie sie vorsichtig um, um sie zu mischen.
Schalten Sie das Spektralfotometer ein und lassen Sie es aufwärmen. Die erforderliche Zeit hängt vom Modell und vom Hersteller ab.
Stellen Sie die Wellenlänge am Spektralfotometer ein. Die Wellenlänge hängt von der Art der Chemikalie in Ihrem Experiment ab. Nehmen Sie zunächst 500 nm an, denken Sie jedoch daran, dass Sie dies für verschiedene Experimente ändern müssen.
Kalibrieren Sie Ihr Spektralfotometer. Das Kalibrierungsverfahren variiert je nach verwendetem Gerät. Bei der Spectronic 20, einem gängigen Modell in Lehrlaboren, stellen Sie die Maschine zunächst so ein, dass sie "0 Prozent T" anzeigt. Wenn keine Küvette geladen ist, stellen Sie sie so ein, dass "100 % T" angezeigt wird, wenn eine Leerküvette mit nur entionisiertem Wasser water geladen. Diese Verfahren können je nach verwendeter Maschine unterschiedlich sein. Einzelheiten hierzu finden Sie in der Anleitung des Herstellers.
Nachdem die Maschine kalibriert wurde, nehmen Sie das Standard-1-Reagenzglas und gießen Sie den Inhalt in eine saubere Küvette, bis er die Fülllinie erreicht. Wischen Sie die Küvette mit einem Kimwipe ab, um Fingerabdrücke oder anderen Schmutz zu entfernen. Setzen Sie die Küvette in das Spektrophotometer ein und notieren Sie den "%T"-Messwert.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle 10 Proben. SEIEN SIE SICHER, die Küvette zwischen den Proben zu reinigen, um sicherzustellen, dass Ihre Ergebnisse so genau wie möglich sind.
Nehmen Sie die Ergebnisse für Ihre Standards und geben Sie sie in ein Tabellenkalkulations-/Grafikprogramm wie Excel oder OpenOffice ein.
Mit dem Tabellenkalkulationsprogramm 100 Prozent durch jeden der "%T"-Werte für die Standards dividieren und dann das Ergebnis protokollieren. Diese Berechnung gibt Ihnen die Extinktion. Wenn Sie die Formel eingeben, übernimmt Ihr Tabellenkalkulationsprogramm die Berechnung für Sie.
Beispiel: Wenn %T 50,6 beträgt, lautet die Formel, die Sie in das Tabellenkalkulationsprogramm eingeben, wie folgt:
log (100 / 50,6)
Das Tabellenkalkulationsprogramm übernimmt die Berechnung.
Machen Sie dasselbe für alle fünf unbekannten/experimentellen Werte.
Zeichnen Sie die Extinktionswerte für alle fünf Standards mit Konzentration auf der x-Achse und Extinktion auf der y-Achse. Passen Sie mit dem Tabellenkalkulationsprogramm eine lineare Gleichung an dieses Diagramm an. Die Gleichung hat die Form y = mx + b. Die meisten Tabellenkalkulationsprogramme verfügen über eine lineare Regressionsfunktion. Einzelheiten zur Verwendung der linearen Regressionsfunktion finden Sie im Benutzerhandbuch Ihres Tabellenkalkulationsprogramms.
Nehmen Sie die Gleichung für die am besten passende Gerade aus Ihrem Tabellenkalkulationsprogramm und lösen Sie sie nach y auf, indem Sie b von beiden Seiten subtrahieren und beide Seiten durch m dividieren. Das Ergebnis sieht wie folgt aus:
(y - b)/m = x
wobei b und m Werte sind, die von Ihrem Tabellenkalkulationsprogramm gefunden werden.
Überprüfen Sie Ihre Extinktionswerte auf die Unbekannten und wählen Sie drei aus, die ungefähr in den gleichen Bereich wie die Standards fallen. Verwenden Sie diese drei Absorptionswerte für Ihre restlichen Berechnungen. Wenn alle fünf in den gleichen Bereich wie die Standards fallen, können Sie stattdessen alle fünf verwenden, müssen jedoch mindestens drei verwenden.
Setze jeden der drei Extinktionswerte in deine Gleichung anstelle von y ein. Denken Sie daran, dass Ihre Gleichung die folgende Form hatte:
(y - b)/m = x
Sie sollten also den Extinktionswert für jede Unbekannte anstelle von y in die Gleichung einsetzen und dann x berechnen. Sie können das Tabellenkalkulationsprogramm verwenden, um diese Berechnung für Sie durchzuführen und zu beschleunigen. Sie haben nun die Konzentration der interessierenden Chemikalie in drei Ihrer verdünnten Unbekannten berechnet. Die Originallösung wurde jedoch verdünnt, um diese Unbekannten herzustellen, daher müssen Sie jetzt rückwärts arbeiten und die Konzentration der Originallösung basierend auf dem Verdünnungsfaktor berechnen.
Jede unbekannte Probe, die Sie in das Spektrophotometer einführten, wurde mit einer anderen Menge verdünnt. Folglich sollten Sie nun die Konzentration, die Sie basierend auf der Extinktion für jeden unbekannten Messwert berechnet haben, durch Folgendes dividieren:
Unbekannt 1: Dividieren durch 0.1 Unbekannt 2: Dividieren durch 0.2 Unbekannt 3: Dividieren durch 0.3 Unbekannt 4: Dividieren durch 0.4 Unbekannt 5: Dividieren durch 0.5
Denken Sie jedoch daran, dass diese Zahlen auf der Annahme basieren, dass Sie die oben beschriebenen Verdünnungen verwenden. Denken Sie daran, diese Werte zu ändern, wenn Sie Ihre Proben um eine andere Menge verdünnt haben.
Addieren Sie Ihre Ergebnisse und teilen Sie sie durch die Anzahl der Ergebnisse. Dadurch erhalten Sie einen Durchschnitt. Geben Sie diese Zahl als Ihr Ergebnis für die Konzentration der Originallösung an.
Dinge, die du brauchen wirst
- Bleistift
- Papier
- Taschenrechner
- Handschuhe
- Brille
- Langarmmantel
- Spektrophotometer
- Glasküvetten
- Parafilm
- Kimwipes
- Entionisiertes Wasser
- Lösung, die Sie testen möchten (unbekannter Konzentration)
- 1 molare Standardlösung der in Ihrer Testlösung enthaltenen Chemikalie
- Messpipette & Kolben
- Reagenzgläser & Reagenzglasständer
- Becherglas
Tipps
Dieses Verfahren mag kompliziert klingen, aber es ist eigentlich ziemlich einfach, wenn Sie einmal angefangen haben. Sehen Sie sich die beiden Videos im Abschnitt Ressourcen an, um sich mit dem Verfahren vertraut zu machen.