Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ist eine biochemische Methode zur Identifizierung von Proteinen in Lösung. Wie von Mathews et al. in "Biochemistry" illustriert, werden Proteinproben zuerst in "Wells" oder Löcher an einem Ende des Polyacrylamid-Gelblocks geladen. An das Gel wird dann ein elektrisches Feld angelegt. SDS, das zu den geladenen Proben hinzugefügt wird, negiert die natürliche Ladung von Proteinen. Aus diesem Grund bestimmt allein das Molekulargewicht des Proteins die Migrationsgeschwindigkeit von Proteinen, wenn sie sich durch das Gel in Richtung des positiv geladenen Pols bewegen, bemerkt Bitesize Bio. Mehrere Proteine in derselben Probe werden sich daher voneinander trennen und an unterschiedliche Positionen wandern.
Richten Sie das Gelfoto aus. "Oben" ist die Position der Wells, in die die Proben ursprünglich hinzugefügt wurden. "Unten" ist der Ort, an dem die Proben hinwanderten, und enthält am häufigsten die Farbstofffront, die die Migrationsfront der Proben anzeigt. Entweder die linke oder die rechte Seite sollte einen "Marker" enthalten, der als vorhersagbarer Molekulargewichtsleitfaden verwendet wird.
Beschriften Sie die Proben für jede Spur. Oben sind die Proben, die den Wells hinzugefügt wurden, vertikal in "Spuren" gewandert. Daher stammen alle in einer vertikalen Spalte sichtbaren Balken von dem einen Sample, das direkt darüber geladen wurde. Verwenden Sie Lineal und Stift, um die Bahnen einzugrenzen, wenn es schwierig ist, Spalten zu visualisieren.
Beschriften Sie die molekularen Größen der Banden in der Markierungsspur. Kommerziell erhältliche Marker enthalten ein Bild des zu erwartenden Bandenmusters zusammen mit den Molekulargewichten jeder Bande. Banden sind die dunklen horizontalen "Balken", bei denen es sich tatsächlich um gefärbtes Protein handelt, das in das Gel eingebettet ist.
Zeichnen Sie leichte horizontale Linien, die sich von jedem Markierungsband zum gegenüberliegenden Rand des Gels erstrecken. Achten Sie darauf, dass diese Linien parallel zu den Vertiefungen und zur Farbstofffront verlaufen. Diese Linien zeigen an, wo Proteine des Molekulargewichts, das von jeder der Markerbanden angezeigt wird, in jeder Spur lokalisiert werden würden. Zum Beispiel ein Band in Spur 4, das sich direkt unter der Linie befindet, die von der 25-Kilodalton-Linie verlängert wird Markerbande würde darauf hindeuten, dass die Bande von Spur 4 fast, aber nicht ganz 25 Kilodalton in molekularer Gewicht.
Beschriften Sie jede Bande in jeder Spur mit ihrem geschätzten Molekulargewicht. Verwenden Sie die Markierungen als Richtlinie und schätzen Sie die Werte zwischen den Markierungsgrößen.
Erstellen Sie unter dem Gelfoto eine Liste der "Proteine" für jede Spur. Beginnen Sie damit, dass Sie angeben, was über jede Probe bekannt ist, z. B. Herkunft oder Bedingungen. Listen Sie dann das geschätzte Molekulargewicht jeder Bande in der Spur auf. Spuren mit einer Bande zeigen an, dass die Probe nur ein Protein enthält. Spuren mit mehreren Banden zeigen das Vorhandensein mehrerer Proteine an. Banden, die mit der Migrationsfront verlaufen, sind kleiner als vom nächstgelegenen Marker vorgeschlagen und können wahrscheinlich nicht vorhergesagt werden, es sei denn, sie sind "kleiner als" der Marker anzeigt.
Merken Sie sich in der Proteinliste Kuriositäten. Ein "verschmiertes" Erscheinungsbild kann darauf hinweisen, dass zu viele Proteine vorhanden sind oder dass die Viskosität der Probe die Migration beeinflusst Rand der Bahn oder sind im Vergleich zu anderen Banden recht groß, dann ist die Konzentration dieses Proteins wahrscheinlich zu hoch und sollte in Zukunft verdünnt werden Elektrophorese. Eine gräuliche Tönung über die gesamte Spur, die dunkler als die Hintergrundfarbe des Gels ist, weist auf nicht unterscheidbare Proteinfragmente hin.
Bestimmen Sie die Identität der Proteine in jeder Spur. Obwohl dies nur unter Verwendung des Molekulargewichts erfolgt, wird die Quelle jeder Spur wahrscheinlich auch Hinweise anzeigen. Bedenken Sie, dass Proteine unter bestimmten Bedingungen eine Dimer- oder Trimer-Assoziation auf einem Gel aufrechterhalten können. Daher kann ein Protein auf einem Gel als drei verschiedene Banden erscheinen. Auch wenn Proteine nicht identifiziert werden können, kann die relative Dunkelheit der Banden auf die Konzentrationen der Proteine in Lösung hinweisen. Alle kuriosen und unbekannten Proteine können direkt aus dem Originalgel isoliert und zur Identifizierung eingeschickt werden.
Dinge, die du brauchen wirst
- Foto von SDS-PAGE-Gel, gefärbt
- Schlüssel für den verwendeten Molekulargewichtsmarker
- Herrscher
- Stift