Polymerasekædereaktion eller PCR er en teknik, der fotokopierer et fragment af DNA i mange fragmenter - eksponentielt mange. Det første trin er i PCR er at opvarme DNA'et, så det denaturerer eller smelter i enkelte tråde. DNA-strukturen er som en rebstige, hvor trinene er reb med magnetiske ender. Magneterne forbinder for at danne trin, kaldet basepar, og modstår således at blive trukket fra hinanden. Hvert fragment af DNA smelter i enkelte tråde ved forskellige temperaturer. At forstå, hvordan strukturen af DNA holdes sammen af DNA's individuelle dele, giver indsigt i hvorfor forskellige DNA-fragmenter smelter ved forskellige temperaturer, og hvorfor der er brug for så høje temperaturer i den første placere.
Smeltning! Smeltning!
Det første trin i PCR er at smelte DNA'et, så dobbeltstrenget DNA separeres i enkeltstrenget DNA. For pattedyrs DNA involverer dette første trin normalt varme på ca. 95 grader Celcius (ca. 200 Fahrenheit). Ved denne temperatur brydes hydrogenbindingerne mellem AT og GC baseparene eller trin i DNA-stigen fra hinanden, hvorved dobbeltstrenget DNA lynlås. Imidlertid er temperaturen ikke varm nok til at bryde fosfat-sukker-rygraden, der danner de enkelte tråde eller stangens poler. Fuldstændig adskillelse af enkelte tråde forbereder dem til det andet trin i PCR, som afkøles for at tillade korte DNA-fragmenter, kaldet primere, at binde de enkelte tråde.
Magnetiske lynlåse
En af grundene til, at DNA opvarmes til den høje temperatur på 95 grader Celcius, er at jo længere DNA-dobbeltstrengen er, jo mere vil den være sammen. DNA-længde er en faktor, der påvirker det smeltepunkt, der er valgt til PCR på det stykke DNA. A-T- og G-C-baseparene i den dobbeltstrengede DNA-binding med hinanden for at holde dobbeltstrengstrukturen sammen. Jo flere sammenhængende basepar mellem to enkeltstrenge er bundet, jo mere ønsker deres naboer også at binde, og jo stærkere bliver tiltrækningen mellem de to tråde. Det er som en lynlås lavet af små magneter. Når du lukker lynlåsen, vil magneterne naturligvis gerne lynlåse op og forblive lynlåse.
Stærkere magneter holder sig tættere fast
En anden faktor, der påvirker hvilken smeltetemperatur, der skal vælges til dit DNA-fragment af interesse, er mængden af GC-basepar, der er til stede i dette fragment. Hvert basepar er som to mini-magneter, der tiltrækker. Et par lavet af G og C tiltrækkes meget stærkere end et A og T par. Således vil et stykke DNA, der har flere GC-par end et andet fragment, kræve en højere temperatur inden smeltning i enkelte tråde. DNA absorberer naturligt ultraviolet lys - for at være nøjagtigt ved bølgelængden på 260 nanometer - og enkeltstrenget DNA absorberer mere lys end dobbeltstrenget DNA. Så måling af mængden af absorberet lys er en måde at måle, hvor meget dit dobbeltstrengede DNA er smeltet i enkelte tråde. Den "magnetiske lynlås" -effekt af GC- og AT-basepar er årsagen til en graf over lysabsorbansen dobbeltstrenget DNA plottet mod en temperaturstigning for at være sigmoidal, formet som en S og ikke en lige linje. S-kurven repræsenterer den holdmodstand, som baseparret udøver mod varmen, fordi de ikke vil adskille sig.
Halvvejspunktet
Temperaturen, ved hvilken en længde af DNA smelter i enkelte tråde, kaldes dens smeltetemperatur, som betegnes med forkortelsen "Tm." Dette indikerer den temperatur, ved hvilken halvdelen af DNA'et i en opløsning er smeltet i enkelte tråde, og den anden halvdel stadig er i dobbeltstreng form. Smeltetemperaturen er forskellig for hvert DNA-fragment. Pattedyrs DNA har et GC-indhold på 40%, hvilket betyder at de resterende 60% af baseparene er As og Ts. Dets 40% G-C-indhold får pattedyrs-DNA til at smelte ved 87 ° C (ca. 189 Fahrenheit). Dette er grunden til det første trin i PCR på pattedyrs DNA er at opvarme det til 94 grader Celcius (201 Fahrenheit). Bare syv grader varmere end smeltetemperaturen, og alle dobbelte tråde smelter helt til enkelte tråde.