DNA
Deoxyribonukleinsyre og proteiner. DNA er organiseret i enheder kaldet gener, som hver koder for en bestemt RNA- eller proteinsekvens. Gener undersøges for at lære om biologisk struktur og funktion, evolution, sygdom og mange andre aspekter af levende systemer. For at studere gener i detaljer skal DNA isoleres og renses fra celler af interesse.
DNA-ekstraktion
Selvom DNA fra en enkelt celle kan udvindes og undersøges, er det ikke nok at se med det blotte øje. For at få en tilstrækkelig mængde til spooling, jo flere celler skal du arbejde med jo bedre (mange millioner).
Præcise protokoller varierer betydeligt for at tage højde for de unikke egenskaber ved specifikke prøver, men de generelle trin er homogenisering, lysis, fordøjelse, separation og samling. Fremgangsmåden udføres bedst i et lille (afhængigt af prøvestørrelsen) glas eller plastrør.
En prøve blandes generelt eller jordes op for at adskille cellerne grundigt fra hinanden. Dette gør celleingredienserne mere tilgængelige for de følgende reagenser. Vaskemiddel eller enzymer tilsættes derefter til homogenatet for at lysere cellemembranerne (og nukleare membraner, hvis cellerne er eukaryote) for at frigøre DNA'et. På dette tidspunkt er DNA'et omgivet af proteiner, lipider, carbohydrat alt andet, der var indeholdt i cellerne.
En yderligere enzymatisk fordøjelse kan være nødvendig for at nedbryde proteiner, så de ikke binder til DNA og interfererer med dets samling. DNA separeres fra resten af celleindholdet ved tilsætning af kold, ren, ethyl- eller isopropylalkohol. DNA er ikke opløseligt i disse alkoholer, så det kondenserer for at forsøge at minimere dets kontakt med alkoholen. De kondenserede DNA'er opsamles derefter, sædvanligvis ved centrifugering eller spoling.
DNA-spoling
DNA-opsamling ved spoling er effektiv, når en stor mængde DNA opnås ved en ekstraktionsprocedure. Det er også en fremragende demonstrationsmetode, da et imponerende virvar af rent DNA er tydeligt synligt.
For at spole DNA skal adskillelsestrin udføres omhyggeligt. Hvis det ikke var en del af lysisreagensblandingen, der tidligere er tilsat, skal der tilsættes en koncentreret saltopløsning (natriumchlorid) til opløsningen før alkoholtilsætningstrinnet. Den kolde alkohol hældes langsomt ned på siden af reagensglasset for at danne et lag oven på den vandige opløsning, hvor man undgår blanding. Hvis det gøres korrekt, danner alkoholen sit eget lag oven på det saltede lag. Så kommer spolen.
For at indsamle DNA'et fra det saltede lag skal du forsigtigt placere en glasrørstang gennem alkohollaget, indtil det rører bunden af røret. Drej langsomt stangen mellem fingrene, mens du ser grænsefladen mellem de to lag. Hvis der er nok DNA til stede, klumper det sig sammen ved grænsefladen mellem lagene for at danne en mælkeagtig gennemskinnelig masse. Drej stangen for at vikle DNA'et omkring den (det vil sige spoledelen) og træk den ud af røret. DNA'et kan overføres til et andet rør med ren alkohol til opbevaring eller yderligere analyse.
