Molekylær kloning er en almindelig bioteknologisk metode, som enhver studerende og forsker skal være fortrolig med. Molekylær kloning ved hjælp af en type enzym kaldet et restriktionsenzym til at skære humant DNA i fragmenter, som derefter kan indsættes i plasmid-DNA'et i en bakteriecelle. Restriktionsenzymer skærer dobbeltstrenget DNA i halve. Afhængigt af restriktionsenzymet kan snittet resultere i enten en klæbrig ende eller en stump ende. Klæbrige ender er mere nyttige i molekylær kloning, fordi de sikrer, at det humane DNA-fragment indsættes i plasmidet i den rigtige retning. Ligeringsprocessen eller sammensmeltning af DNA-fragmenter kræver mindre DNA, når DNA'et har klæbrige ender. Endelig kan flere klæbrige endebegrænsningsenzymer producere den samme klæbrige ende, selvom hvert enzym genkender en anden begrænsningssekvens. Dette øger sandsynligheden for, at din DNA-region af interesse kan blive skåret ud af klæbrige enzymer.
Begrænsningsenzymer og begrænsningssteder
Restriktionsenzymer er enzymer, der skærer genkender specifikke sekvenser på dobbeltstrenget DNA og skærer DNA'et i halv ved denne sekvens. Den genkendte sekvens kaldes restriktionsstedet. Restriktionsenzymer kaldes endonukleaser, fordi de skærer dobbeltstrenget DNA, hvilket er, hvordan DNA normalt eksisterer, på steder, der ligger mellem DNA-enderne. Der er mere end 90 forskellige restriktionsenzymer. Hver genkender et særskilt restriktionssted. Restriktionsenzymer spalter deres respektive restriktionssteder 5.000 gange mere effektivt end andre steder, som de ikke genkender.
Den rigtige orientering
Restriktionsenzymer findes i to generelle klasser. De skærer enten DNA i klæbrige ender eller stumpe ender. En klæbrig ende har en kort region af nukleotider, byggestenene i DNA, der er uparret. Denne uparrede region kaldes et overhæng. Overhænget siges at være klæbrig, fordi det vil og vil parre med en anden klæbrig ende, der har komplementær overhængssekvens. Klæbrige ender er som tvangs tvillinger, der forsøger at kramme hinanden tæt, når de mødes. På den anden side er stumpe ender ikke klæbrige, fordi alle nukleotiderne allerede er parret mellem de to DNA-tråde. Fordelen ved klæbrige ender er, at et fragment af humant DNA kun kan passe ind i et bakterieplasmid i en retning. I modsætning hertil, hvis både det humane DNA og det bakterielle plasmid har stumpe ender, kan det humane DNA indsættes head-to-tail eller tail-to-head i plasmidet.
Ligering af klæbrige ender kræver mindre DNA
Skønt DNA med stavender har lettere ved at finde hinanden på grund af deres "klæbrighed", kan hverken klæbrige ender eller stumpe ender smelte sammen til et kontinuerligt stykke DNA. Dannelse af et kontinuerligt stykke DNA, der er fuldstændigt forbundet, kræver et enzym kaldet en ligase. Ligaser forbinder rygraden af nukleotider i de klæbrige eller stumpe ender, hvilket resulterer i en kontinuerlig kæde af nukleotider. Fordi klæbrige ender finder hinanden hurtigere på grund af deres tiltrækningskraft for hinanden, kræver ligeringsprocessen mindre humant DNA og mindre plasmid-DNA. De stumpe ender af DNA og plasmider er mindre tilbøjelige til at finde hinanden, og ligering af stumpe ender kræver således, at mere DNA sættes i reagensglasset.
Forskellige enzymer kan give den samme klæbrige ende
Restriktionssteder er placeret i hele organismenes genom, men er ikke jævnt fordelt. I plasmider kan de konstrueres til at være placeret lige ved siden af hinanden. Forskere, der ønsker at skære et fragment af humant DNA ud af det menneskelige genom, skal finde restriktionssteder, der er foran og bag på fragmentet. Ud over at sikre, at et DNA-fragment indsættes i den rigtige retning, kan forskellige klæbrige enzymer skabe den samme klæbrige ende, selvom de genkender forskellige restriktionssekvenser. For eksempel har BamHI, BglII og Sau3A forskellige genkendelsessekvenser, men producerer den samme klæbrig ende af GATC. Dette øger sandsynligheden for, at der vil være klæbrige slutbegrænsningssteder, der flankerer dit humane gen af interesse.