Hvordan en prøve af DNA indsamles og forberedes til undersøgelse

Inden de kan sekvensere DNA eller ændre det gennem genteknologi, skal forskere først isolere det. Dette kan virke som en vanskelig opgave, da celler indeholder en lang række andre forbindelser som proteiner, fedt, sukker og små molekyler. Heldigvis kan biologer gøre brug af DNA's kemiske egenskaber til at adskille DNA fra disse forurenende stoffer og forberede det til yderligere undersøgelse. Denne proces kaldes DNA-ekstraktion.

Der er mange forskellige teknikker, der anvendes til DNA-ekstraktion. Den, der bruges af et individuelt laboratorium, afhænger af typen af ​​eksperiment, der skal udføres, og hvor rent DNA skal være. Forskere starter generelt med en prøve, der indeholder celler - f.eks. En vævs- eller blodprøve - og bryder cellerne op eller lyserer dem. Der er forskellige måder, du kan lysere celler på. Tilføjelse af et rengøringsmiddel får dem til at skilles fra hinanden, ligesom de udsættes for højfrekvente lydbølger. Alternativt kan blanding af prøven med glasperler og vibrering af den hurtigt bryde cellerne fra hinanden og frigøre deres indhold.

Hvis høj renhed ikke er påkrævet, kan forskere tilføje et enzym kaldet proteinase K for at nedbryde de fleste proteiner i prøven og derefter bruge det som det er. Denne teknik er dog meget snavset, da de fleste forureninger stadig er til stede, så den er kun egnet, hvis hastighed er en prioritet, og renhed ikke er noget problem. En anden hurtig og beskidt tilgang er at fjerne proteiner ved at øge saltkoncentrationen ved at tilsætte salte som ammonium eller kaliumacetat for at tvinge proteinerne til at udfælde. Denne teknik er også ret snavset, da mange andre forurenende stoffer stadig er til stede.

En anden fremgangsmåde er at lysere cellerne med vaskemiddel og derefter blande opløsningen med isoamylalkohol, chloroform og phenol. Opløsningen adskilles derefter i to lag. Proteiner ender i det øverste organiske lag, mens DNA forbliver i det nedre vandige lag. Denne teknik kræver nøje kontrol af saltkoncentration og pH for at opnå gode resultater. Det er tidskrævende, og både phenol og chloroform er meget giftige kemikalier. Selvom ekstrakter med phenol-chloroform engang var rutinemæssige, er andre teknikker blevet mere populære i de senere år.

Anion-udvekslingskromatografi giver højere renhed og mere konsistente resultater end phenol-chloroform-ekstraktion. Et rør eller en søjle er pakket med små partikler, der har positivt ladede steder på sig, hvor et negativt ladet molekyle eller anion kan binde. DNA binder til disse anionbyttersteder, mens andre forurenende stoffer som proteiner og RNA vaskes ud af søjlen. Senere bruges en saltrig opløsning til at trække DNA'et ud af søjlen.

Den hurtigste og måske mest pålidelige teknik til oprensning af DNA er brugen af ​​et specielt fremstillet sæt. Disse sæt indeholder silicagelmembraner i et rør. DNA'en klæber til membranen, mens andre forurenende stoffer skylles væk ved hjælp af en række specielt fremstillede saltopløsninger, der følger med sættet. Til sidst vaskes DNA'et fra søjlen med en opløsning med lavt saltindhold. Disse sæt er hurtige, nemme at bruge og giver reproducerbare resultater.

Når først DNA'et er isoleret og resuspenderet i en pH-kontrolleret bufferopløsning, er det sidste trin at teste dets renhed. En nem og bekvem måde at gøre det på er ved at kontrollere, hvor meget ultraviolet lys det absorberer ved 260 og 280 nanometer bølgelængder. Absorptionen ved 260 nanometer divideret med absorptionen ved 280 nanometer skal være lig med 1,8, hvis DNA'et er rent. Måling af absorbans ved 260 nanometer giver dig også mulighed for at bestemme koncentrationen af ​​DNA'et.