Western blotting er en af de mest almindelige procedurer i biokemiske laboratorier. Dybest set adskiller det proteiner fra en prøve efter størrelse og tester derefter ved hjælp af antistoffer for at bestemme, om et givet protein er til stede. Det er nyttigt ikke kun i forskning, men også i medicinske eller diagnostiske laboratorier; test for både HIV og Lyme-sygdom involverer for eksempel en enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) test efterfulgt af en Western blot, hvis ELISA tester positivt. På trods af sin popularitet har Western blotting dog flere ulemper.
Ikke-kvantitativ
Klassiske Western-blots er ikke-kvantitative. Med andre ord, selvom de kan fortælle forskere, om et bestemt protein er til stede, gør de det ikke muligt at kvantificere, hvor meget af proteinet der er til stede. Nogle biotekvirksomheder sælger nu sæt, der gør det muligt for forskere eller laboratorieteknikere at kvantificere mængden af protein til stede ved hjælp af en standardkurve - men dette fungerer kun, hvis der er rene prøver af det samme protein ledig. Desuden kan molekylvægten af et protein kun estimeres med Western blotting snarere end bestemt præcist som med massespektrometri.
Antistoffer
En Western blot kan kun udføres, hvis der er primære antistoffer mod proteinet af interesse. Mens antistoffer til mange forskellige proteiner er tilgængelige fra biotekvirksomheder, er de ikke billige; hvis primære antistoffer ikke er tilgængelige for et givet protein, vil det ikke være muligt at udføre en Western blot på udkig efter det specifikke protein. Desuden vil forskere måske bestemme, om et protein er blevet modificeret på en eller anden måde - hvis det er blevet phosphoryleret (havde en fosfatgruppe bundet til den), for eksempel - og med Western blot-teknikken har de brug for antistoffer, der er specifikke for det modificerede protein.
Uddannelse
Det kan være udfordrende at udføre en Western blot korrekt og få gode resultater, så personalet skal være veluddannet. I dette som i meget andet er oplevelse måske den bedste vejleder; selv for en erfaren tekniker er en Western blot dog tidskrævende. Gelelektroforese-delen af eksperimentet vil f.eks. Typisk tage fra en til to timer at køre. Andre opgaver kan selvfølgelig udføres, mens gelen kører, men eksperimentet tager stadig lang tid at få resultater.
Andre begrænsninger
Antistoffer kan undertiden udvise en vis off-target binding, hvilket kan give dårligere resultater. Desuden med Western blotting bruger du et antistof mod et specifikt protein, så dine resultater vil kun fortælle dig, om dette protein var til stede. Massespektrometri med høj opløsning afslører derimod alle proteinerne, der er til stede i en prøve, og i modsætning til klassisk Western-blotting er den kvantitativ. Det er naturligvis vigtigt at huske, at massespektrometri er meget dyrere og også mere teknisk udfordrende at bruge sammenlignet med Western blotting.
