Formål med cellelyseløsning

Celler er de grundlæggende enheder i livet, da de er de mest enkle, gentagne biologiske "objekter", der bærer de vigtigste egenskaber forbundet med livet, såsom reproduktion og stofskifte. Som selvstændige enheder har de en veldefineret fysisk form og ligesom med hverdagsplanter og dyr, kan tilstrækkelig fysisk forstyrrelse af dette "kar" hurtigt føre til tab af liv for organismen i spørgsmål.

Membranens omgivende celler gør sit arbejde ekstremt godt, idet de har bevaret sin samme grundlæggende form i alt liv på jorden i hundreder af millioner af år. Men det er ikke en magisk barriere, og den kan ødelægges dødeligt af forskellige slags kræfter, hvilket fører til, at celle og dens indhold på samme måde som f.eks. en gummiballon, der er overfyldt med juice og frugt og derefter popper.

Cellelyse er dette at bryde fra hinanden af ​​en celle af en eller anden ekstern kraft. Mens det er fatalt for cellen, er der visse situationer, hvor menneskelige forskere ønsker at lysere en celle eller celler for at komme til indholdet uden at ødelægge dem. (Tænk på gamle bankrobberfilm, hvor de onde prøver at sprænge en hvælving uden at brænde pengene inde.) A

Celler findes i to grundlæggende typer, der afspejler de to taksonomiske domæner ved "roden" af livets forgrenede træ: prokaryotisk og eukaryotisk, med de tilsvarende domæner Prokaryota (bakterier og andre encellede eller encellede organismer) og Eukaryota (planter, dyr, protister og svampe, meget få af dem encellede).

Prokaryote celler har normalt lidt mere for sig end de fire elementer, der er fælles for alle levende celler: a celle membran, a cytoplasma ("goo", der udgør det meste af celleindretningen), genetisk materiale i form af DNA (deoxyribonukleinsyre) og ribosomer til fremstilling af proteiner. På den anden side indeholder eukaryote celler en masse andre funktioner, herunder en kerne omkring deres DNA.

Det vigtigste kendetegn, der adskiller eukaryote celler fra prokaryote celler, er, at eukaryote celler har membranbundet organeller. Plasmamembranen omkring disse strukturer er praktisk talt identisk med den omkring cellen som helhed, og de er således sårbare over for de samme slags fysiske og kemiske trusler.

Faktisk kaldes en slags organel, en lysosom, har det eneste formål at opløse affaldsprodukter fra cellemetabolisme for at slippe af med dem.

Cellelyse vil i forbindelse med denne artikel henvise til den målrettede lysering af celler fra mennesker, så indholdet kan opnås intakt, ikke kun til den fysiske eller kemiske begivenhed af lysis. Hvad er nogle af de ting inde i celler, som forskere og andre måske vil have adgang til?

Hvis du ikke kan tænke på en grund fra toppen af ​​dit hoved, skal du overveje den del af en celle, som du ser fungerer mere eller mindre som dens hjerne. Det ville være det kerne (i eukaryoter) af agglomerering af DNA, der ligner en membranfri, diffus kerne (i prokaryoter).

Det genetiske materiale har "hukommelse" i reel forstand, da det bevarer information meget som dit sind gør, selvom det bruger forskellige processer. DNA er derfor et uvurderligt mål for videnskabsarbejdere, der har brug for at udtrække det fra celler intakt ved hjælp af en lyseringsmetode.

Celler indeholder en række andre stoffer af interesse for medicinske og andre forskere og laboratoriearbejdere, herunder DNA-søskende RNA (ribonukleinsyre) og en række proteiner, hormoner og andre makromolekyler. Proteinekstraktion specifikt diskuteres nedenfor.

Lyse er simpelthen processen med at bryde noget fra hinanden på det mikroskopiske niveau. Det betyder stort set det samme som at "opløse", bortset fra at du ikke kan se det ske med dit blotte øje. Forskere og andre har nu forskellige måder at lysere celler til strategisk formål.

(Husk, mens en celle dør, når den lyseres, betyder det ikke, at "lyse" svarer til "ødelægge.")

Generelt inkluderer disse metoder til cellelyse mekanisk og ikke-mekaniske lyseringsmetoder, hvor de sidstnævnte tre inkluderer fysiske, kemiske og biologiske midler til at skabe cellelyse. Brug af en cellelyse-bufferopløsning kvalificerer sig som en kemisk metode.

Mekanisk afbrydelse af cellen kan have form af a perlemølle, hvor små glas-, metal- eller keramiske kugler rystes med høj hastighed sammen med en flydende blanding af de interesserede celler. I denne metode bryder perlerne blot cellerne åbne.

Alternativt sonikering, eller brugen af ​​lydbølger, tilvejebringer en anden type effektiv cellemembranforstyrrelse via et mekanisk apparat, der kan være effektivt. Disse lydbølger har en frekvens på ca. 20 til 50 kHz eller 20.000 til 50.000 slag pr. Sekund. Metoden er støjende og skaber også nok varme til at gøre denne metode besværlig for især varmefølsomme materialer.

Fysisk lysis:Osmotisk chok er en måde at lysere celler på; det sænker det ioniske "træk" af mediet, cellerne befinder sig i, hvilket kan få vand til at forlade mediet og strømme ind i cellerne. Dette kan igen få celler til at svulme op og sprænge. Surfaktanter er en slags vaskemiddel, der kan bruges til at forstyrre cellemembraner i denne proces.

Mest bakterie, gær og plantevæv er imidlertid resistente over for osmotiske stød takket være deres cellevægge, som eukaryote celler som regel mangler. Som et resultat kræves der normalt stærkere afbrydelsesteknikker.

EN cellebombe er et andet fysisk middel til at forstyrre celler. Her placeres celler under meget højt tryk (op til 25.000 pund per kvadrattomme eller ca. 170 millioner pascal). Når trykket frigøres hurtigt, forårsager den pludselige trykændring, at gasser, der er opløst i celler, frigøres som bobler. Dette åbner igen cellerne.

Biologisk lysis:Enzymer kan være nyttige til at hjælpe med at nedbryde bakterievæggene. Lysozym er for eksempel meget nyttigt til nedbrydning af cellevæggen af ​​bakterier, som er en mere robust barriere end cellemembranen. Andet enzymer almindeligt anvendt inkluderer cellulase (som nedbryder stivelse) og proteaser (som nedbryder proteiner).

Kemisk lysis: Rengøringsmidler anvendes, som bemærket, under osmotisk shock-metoden til cellelyse, men kan også anvendes i stand-alone cellelyse ved anvendelse af en kemisk opløsning alene. Disse rengøringsmidler arbejde simpelthen ved at gøre proteinerne indlejret i celle membran (som for det meste er fosfat og lipider) mere opløseligt, hvilket gør det lettere for membranen som helhed at nedbrydes.

Udtrykket "cellelyseopløsning" bruges undertiden, men ikke altid, ombytteligt med "lysepuffer." Så det er nyttigt at kende det specifikke ingredienser i en kemisk cocktail designet specielt til at nedbryde cellemembranen uden at gå på kompromis med celleintegriteten indhold.

En typisk lyseringsbuffer kan indeholde en blanding af buffersalte, såsom følgende:

• 50 mM Tris-HCI pH 7,5 (en industriel buffer med et let alkalisk eller basisk pH- eller hydrogenionniveau)
• 100 mM NaCl (bordsalt)
• 1 mM DTT (specifikt til proteiner)
• 5% glycerol (en sukkeralkohol og "rygraden" i lipider)

Proteinekstraktion er en enkel proces, i det mindste i princippet. Først lyseres cellerne, hvorfra et specifikt protein tages. Hvilken som helst af de ovenfor beskrevne metoder er valgt, når først proteinet er opsamlet, vil det skal normalt adskilles fra en masse baggrundsmateriale, der i det mindste til nuværende formål er uønsket.

For eksempel, nukleinsyrer (DNA og RNA) finder næsten altid vej ind i lysateller løsningen, der indeholder det frigjorte celleindhold. Specielle kemiske præparater kan bruges til at "vaske" nukleinsyren fra opløsningen og efterlade det meste protein. Yderligere kemiske og fysiske trin vil føre til større og større renhed i det protein, der indsamles.