Hvordan fremstilles rekombinant DNA?

Rekombinant DNA (deoxyribonukleinsyre) er en syntetisk type nukleinsyre dannet ved at forbinde DNA sekvenser sammen, der ikke naturligt ville eksistere under normale omstændigheder og miljømæssige betingelser.

Fremgangsmåden til fremstilling af rekombinant DNA udføres sædvanligvis med et rekombinant plasmid. Specifikt er det lavet af en avanceret DNA-teknologiprocedure inden for biologi og genetik kendt som genkloning. Rekombinant DNA anbringes i en celle, som derefter producerer et helt nyt protein og bruges til at syntetisere lægemidler, antistoffer eller specifikke proteiner til kun forskning.

DNA fra en donororganisme eller biologisk kilde ekstraheres først fra celler og underkastes derefter en skæreproces kendt som enzymatisk begrænsning. Dette genererer fragmenter af DNA, der indeholder genet eller generne af interesse. Disse fragmenter kan derefter "klones" (dvs. indsættes) eller fastgøres på fragmenter fra modtagerorganismen.

De indsættes derefter i større DNA-molekyler (et "rekombinant plasmid"), som placeres i en bakterie og får lov til at formere sig. Det rekombinante DNA udvindes derefter og verificeres.

Læs mere om fordele og ulemper ved rekombinant DNA-teknologi.

DNA skal først ekstraheres og oprenses fra andre cellulære molekyler, såsom ribonukleinsyrer (RNA'er), proteiner og strukturer såsom cellemembraner. Til kloningsformål opnås DNA fra kernen og er kendt som "genomisk DNA." En almindelig metode til DNA ekstraktion sker ved ultracentrifugering af cellekomponenter i en densitetsgradient bestående af ethidiumbromid i cæsium klorid.

Alternativt kan en række alkaliske vaske- og saltbuffervaskes også anvendes til at udvinde DNA'et. Når dette er udfældet og renset for alle andre uønskede forurenende stoffer, kan DNA skæres i fragmenter.

Restriktionsenzymer er enzymer, der skærer meget specifikke DNA-sekvenser op; de bruges til at skabe unikke DNA-fragmenter. Denne proces sikrer, at der ikke genereres og bliver unøjagtige, forkerte eller uønskede sekvenser ved et uheld inkorporeret i det endelige rekombinante DNA, hvilket kan resultere i både eksperimentel fiasko og celledød.

For at generere de ønskede DNA-fragmenter anvendes et specifikt (eller en kombination af) enzym (er) til at skære op eller fordøje DNA'et. Fragmenterne oprenses derefter ved gelelektroforese, som adskiller dem fra det uønskede DNA. En rå DNA-teknologimetode involverer simpelthen mekanisk klipning, som river de længere DNA-segmenter op i mindre, der kan bruges til kloning.

Ligering er processen med at klæbe eller forbinde donor- og modtager- (eller vektor) DNA-fragmenter til dannelse af et rekombinant plasmid-DNA-molekyle. Ideelt set ville de begrænsningsenzymer, der blev valgt til at skabe fragmenterne, være meget omhyggeligt gennemtænkt og designet således, at de tillader, at disse bits sættes sammen som et puslespil.

For at gøre dette foretrækkes restriktionsenzymer, der producerer kompatible "klæbrige ender", således at alle kompatible fragmenter naturligt forbinder hinanden. Ellers kan DNA-ligase-enzymet bruges til at forbinde DNA-segmenterne med phosphodiesterbindinger.

Processen med transformation eller varmechok bruges til at placere det rekombinante DNA-molekyle i en værtsbakteriecelle, som derefter kan generere mange kopier af det syntetiske DNA. Disse bakterier dyrkes på agarplader, dyrkes op i specielle bakterievæsker og lyseres derefter for at frigive det rekombinante DNA. Endelig kan DNA'et verificeres ved DNA-sekventering, funktionelle eksperimenter og fordøjelse af restriktionsenzym.

Rekombinant DNA-teknologi bruges til alt fra akademiske laboratorieeksperimenter til oprettelse af farmaceutiske lægemidler. Det er også en vigtig del af DNA-sekventering og genidentifikation.

Du kan læse mere om anvendelser til dette DNA-teknologi her.

Læs mere om forskellen mellem rekombinant DNA og genteknologi.