Co je to Freeze Fracturing a proč je to užitečné v buněčné biologii?

Buněčné membrány sestávají z fosfolipidů a připojených nebo zabudovaných proteinů. Membránové proteiny hrají zásadní roli v metabolismu a životě buňky. K vizualizaci nebo charakterizaci adhezivních proteinů, transportních proteinů a proteinových kanálů v buněčné membráně nemůžete použít běžnou mikroskopii. Pomocí elektronové mikroskopie a techniky zvané „freeze fracture“, která rozděluje zmrzlé buněčné membrány od sebe, umožňuje vizualizaci struktury membrány a organizaci proteinů v moři fosfolipidy. Kombinace dalších metod s mrazovým štěpením nám nejen pomáhá pochopit strukturu různých buněčných membrán a membránové proteiny, ale umožňuje vizualizaci a podrobnou analýzu funkce specifických proteinů, bakterií a viry.

Pomocí kapalného dusíku se biologické vzorky tkáně nebo buňky rychle zmrazí, aby se znehybnily složky buněk. Buněčné membrány se skládají ze dvou vrstev fosfolipidů, nazývaných dvojvrstva, kde hydrofobní nebo vodou nenávidící lipidové ocasy ukazují na vnitřek membrány a hydrofilní nebo vodou milující konce lipidové molekuly směřují ven a směrem dovnitř buňka. Zmrazený vzorek je popraskán nebo rozlomen mikrotomem, což je nástroj podobný noži na řezání tenkých plátků tkáně. To způsobí, že se buněčná membrána přesně rozdělí mezi oběma vrstvami, protože přitažlivost mezi hydrofobními lipidovými ocasy představuje nejslabší místo. Po štěpení je vzorek podroben vakuové proceduře zvané „zmrazení leptáním“. Povrch zlomeného vzorek je zastíněn uhlíkem a platinou, aby byla vytvořena stabilní replika, která sleduje kontury zlomeniny letadlo. Kyselina se používá k trávení organického materiálu ulpívajícího na replice a zanechávajícího tenkou platinovou skořápku rozbitého povrchu membrány. Tento plášť je poté analyzován elektronovou mikroskopií.

Mrazící leptání je vakuové sušení nefixovaného, ​​zmrazeného a mrazem rozbitého biologického vzorku. Postup vakuového sušení je podobný zmrazení ovoce a zeleniny, které jsou baleny a prodávány v obchodech s potravinami. Bez leptání mrazem je mnoho detailů buněčné struktury zakryto ledovými krystaly. Krok hlubokého nebo mraženého leptání vylepšuje a rozšiřuje původní metodu lomového mrazu, což umožňuje pozorování buněčných membrán během různých činností. Umožňuje analýzu nejen struktury membrány, ale také intracelulárních složek a poskytuje podrobné strukturální informace o bakteriích, virech a velkých buněčných bílkovinách komplexy.

Elektronová mikroskopie dokáže odhalit a zvětšit více než milionkrát nejmenší organismy nebo struktury, jako jsou bakterie, viry, intracelulární složky a dokonce i proteiny. Vizualizace se vytváří bombardováním ultratenkého vzorku paprskem elektronů. Tyto dvě metody elektronové mikroskopie jsou skenovací elektronová mikroskopie neboli SEM a transmisní elektronová mikroskopie neboli TEM. Zmrazené vzorky zlomenin jsou rutinně analyzovány pomocí TEM. TEM má lepší rozlišení než SEM a nabízí strukturální informace až do 3 nanometrů replik.

Vývoj a použití elektronové mikroskopie zmrazeného lomu ukázalo, že buněčné plazmatické membrány jsou tvořeny lipidovými dvojvrstvy a objasnilo, jak jsou proteiny organizovány v buněčných membránách. Zmrazená zlomenina poskytuje jedinečný pohled na vnitřek buněčných membrán, protože rozděluje a odděluje membránové fosfolipidy na dva protilehlé a doplňkové listy nebo tváře. Za více než 50 let od zavedení prvního stroje pro lomové mražení je výroba repliky platiny stále jediným způsobem, jak získat strukturální informace o buněčné membráně. Tato technika ukazuje, zda specifické proteiny plují nebo jsou ukotveny v buněčné membráně, a zda a jak se některé proteiny agregují. Novější metoda - pomocí protilátek, které se zaměřují na specifické proteiny - je kombinována s mrazovou zlomeninou k identifikaci proteinů a jejich funkce v buněčné membráně.