Gelová elektroforéza je běžně používaná laboratorní technika s mnoha praktickými aplikacemi, včetně otisků prstů DNA a sekvenování genomu. Proces zahrnuje oddělení DNA fragmenty pomocí elektrického proudu při sledování rychlosti molekulárního pohybu přes filtrační gel.
Přidání modrého nebo oranžového sledovacího barviva do bezbarvých vzorků DNA vám umožní vidět váš vzorek a získat informace o tom, jak se molekuly DNA pohybují během elektroforézy. Identifikace je založena na velikosti pásů DNA na gelu po migraci molekul.
Jak funguje gelová elektroforéza
Gelová elektroforéza táhne fragmenty DNA přes gel pomocí elektrického proudu k izolaci a identifikaci molekul DNA podle velikosti a elektrického náboje. Gel je často vyráběn s agarózový prášek - polysacharid extrahovaný z Mořská řasa.
Agaróza se přidá k pufrovacímu roztoku vody a soli a směs se zahřeje a ochladí, aby se vytvořil porézní gel, který bude působit jako filtrační matrice během postupu elektroforézy. Gel se poté umístí do elektroforetické jednotky a přikryje vodivým pufrovacím roztokem elektřina.
Roztoky obsahující DNA a nanášecí barviva se napipetují do malých jamek v gelu, které se musí připravit během přípravy gelu. Barvivapomoct tijasně vidět vzorek které přidáváte do gelových jamek umístěných v blízkosti záporné elektrody jednotky pro elektroforézu.
Kladná elektroda je umístěna na opačném konci. Do první jamky se umístí známý standard fragmentů DNA, který vytvoří žebřík pásů DNA pro účely srovnání a identifikace.
Fosfátová kostra molekul DNA dává DNA negativní náboj. Protiklady přitahují, takže v důsledku toho jsou molekuly DNA přitahovány ke kladné elektrodě a po zapnutí elektrického proudu se začnou pohybovat nebo „migrovat“.
Fragmenty DNA menší velikosti cestují rychleji než větší fragmenty, protože při migraci porézní matricí gelu narážejí na menší odpor. Fragmenty DNA podobné velikosti tvoří pásy DNA v gelu.
Načítání účelu a důležitosti barviva
DNA je bezbarvá, takže přidání sledovací barviva na vzorek vám pomůže určit rychlost pohybu různých velikostí proteinových molekul v gelu během elektroforézy. Mezi příklady nanášení barviv, která se pohybují se vzorkem DNA, patří bromfenolmodrý a xylenkylalkohol.
Zvolené barvivo by nemělo být reaktivní ani neměnit DNA. Bromofenolová modř je barvivo používané ke sledování menších řetězců DNA, které obsahují přibližně 400 párů bází, zatímco xylencyanol je vhodnější pro větší řetězce DNA s až 8 000 páry bází. Zvolené barvivo by nemělo být reaktivní ani neměnit DNA.
Úloha glycerolu v elektroforéze na agarózovém gelu
Když připravujete svůj vzorek DNA na elektroforéza, budete muset přidat glycerol a vodu spolu s nanášecími barvivy. Glycerol je těžká, sirupovitá látka, která dává vzorku DNA větší hustotu před vložením do jamek na jednom konci gelového listu.
Bez glycerolu by se vzorek DNA rozptýlil, místo aby se ponořil a vytvořil vrstvu ve studni, jako by to mělo dělat, aby se vytvořil žebřík DNA.
Sledování barviva na SDS PAGE
Gelová elektroforéza s dodecylsulfátem sodným na polyakrylamidu (SDS PAGE) je technika vhodná pro separaci proteinů a aminokyselin, které jsou menší a složitější než lineární molekuly DNA. Pro elektroforézu se místo agarózového gelu používá polyakrylamid (gel SDS PAGE).
Bromfenolová modř (BPB) se přidá do vzorkového pufru jako a sledovací barvivo který se pohybuje stejným směrem oddělování proteinů a ohraničuje jejich náběžnou hranu.
Role barviva vázajícího DNA
Barvivo vázající DNA, jako je oranžová barva ethidiumbromid lze přidat do gelu nebo do elektroforetického pufru. Jak název napovídá, barvivo se váže na molekulu DNA.
Při manipulaci s tímto mutagenním barvivem je třeba postupovat velmi opatrně, protože se může vázat na DNA v kožních buňkách. Na rozdíl od stopovacích barviv, ethidiumbromid fluoreskuje jasně pod UV světlozviditelňující pásy DNA.
