Kapalný živný bujón se používá ke kultivaci bakterií, jako je Escherichia coli. Recepty tohoto bujónu se liší v závislosti na bakteriálních druzích a přítomnosti genetických modifikací, např. Rezistence na antibiotika. Bujón lze ztuhnout přidáním agaru, který umožňuje bakteriím vytvářet odlišné kolonie, zatímco v kapalné kultuře se jednoduše dispergují po celém objemu. Toto je základní, ale nezbytná technika pro pokročilé metody, jako je genové klonování nebo mikrobiologické testy. Tento článek předpokládá, že standardní laboratorní kmeny Escherichia coli mají být kultivovány na agarových plotnách s bujónem Luria (LB) (nebo Petriho miskách).
Odvažte 10 gramů tryptonu bakteriální kvality, 5 gramů kvasnicového extraktu, 5 gramů chloridu sodného, 15 gramů agaru nebo agarózy a 1 mililitr 1N hydroxidu sodného. Smíchejte je s objemem destilované a autoklávované sterilní vody, dokud nezískáte 1 litr média. Médium autoklávujte ve volně uzavřených lahvích nebo baňkách po dobu 25 minut. Před přidáním činidel, která se při vysoké teplotě zničí, nechte vychladnout na přibližně 50 stupňů Celsia, jako jsou antibiotika nebo jiné doplňky výživy.
Nechte autoklávované médium vychladnout na 50 stupňů Celsia a ne méně než 45 stupňů Celsia, protože agar se před nalitím usadí v nádobě. Připravte si sterilní Petriho misky a nalijte dostatečné množství tak, aby pokrylo celou plochu talíře a alespoň polovinu jeho hloubky. Vyvarujte se přeplnění talířů a nejlépe nedovolte, aby se agar dotýkal horního okraje misky. Nechte destičky ztuhnout ve sterilním prostředí (např. Pod digestoří s laminárním prouděním) tak, že necháte víčka vypnutá a v rohu digestoře.
Desky osušte. I když je možné destičky použít hned po jejich usazení, na povrchu agaru bude přítomna určitá vlhkost, která zabrání dostatečnému přilnutí bakteriálních kolonií. Proto je nejlepší destičky před aplikací bakterií vysušit, například tak, že je necháte sedět pokojová teplota několik dní nebo půl hodiny pod digestoří s laminárním prouděním nebo při teplotě 37 stupňů Celsia inkubátor.
Uložte talíře. Vysušené talíře by měly být naskládány obráceně na jejich víčka a vráceny do původního stavu balení, podlepené a buď zabalené do fólie na ochranu před světlem, nebo do vhodného obalu kontejner. Na destičky vždy napište datum přípravy a nepoužívejte je, pokud jsou destičky starší než 2 měsíce.
Reference
- „Současné protokoly v molekulární biologii“; Karen Elbing a Roger Brent; 2002
Tipy
- Proveďte co nejvíce z výše uvedených kroků (nejlépe všechny) ve sterilním prostředí (např. Pod otevřený plamen nebo digestoř s laminárním prouděním), aby se zabránilo vniknutí bakteriálních kontaminantů přenášených vzduchem a jejich růstu v média.
o autorovi
Palmer Owyoung je držitelem titulu Master of Arts v mezinárodním obchodu na Kalifornské univerzitě v San Diegu a Bakalář umění v sociologii z University of California v Santa Barbaře a je vyškolený molekulár biolog. Od roku 2006 je spisovatelem na volné noze. Kromě psaní se věnuje obchodování na Forexu a internetovému marketingu na plný úvazek.
Fotografické kredity
Jupiterimages / Comstock / Getty Images