V molekulární biologii může být dobrá volba pufru a příprava pro různé kroky izolace DNA rozdíl mezi přechodem na expresi bílkovin nebo otevřením další sady maxi-prep pro začátek přes. Navzdory jejich zásadnímu významu jsou recepty pufrů často právě to - recepty napsané bez vysvětlení nebo zdůvodnění různých složek. Jedním takovým pufrem je pufr glukóza-tris-EDTA nebo GTE.
Na co se GTE používá?
GTE se používá k resuspendaci pelet bakteriálních buněk před lýzou (rozbitím) buněk a sklizením plazmidové DNA uvnitř. Spolu s pufrem GTE se často přidává lyzozym, který změkčuje buněčné membrány. Dosažení homogenní suspenze celých buněk během tohoto kroku, aby se následně přidaný lyzační roztok mohl dostat ke všem buňkám, je klíčem k získání dobrých výtěžků DNA. GTE je k tomu navrženo a zároveň poskytuje stabilní prostředí pro DNA.
Glukóza pro osmolaritu
Do pufru GTE se přidá 50 mM (milimolární) glukózový cukr, aby se zachovala osmolarita, kde koncentrace rozpuštěné látky mimo buňky je blízká koncentraci uvnitř buněk. Tím se zabrání předčasné lýze buněk, což může způsobit nižší výtěžky DNA v důsledku agregace a degradace. Ostatní složky pufru také přispívají k osmolaritě roztoku, ale glukóza, být neelektrolytem, je dobrá volba, protože nezasahuje do pufru roztoku vlastnosti.
Tris pro stabilitu pH
Tris je zkrácený název pro tris (hydroxymethyl) aminomethan, což je velmi běžný pH pufr. V případě pufru GTE se do pufru přidá kyselá sůl (Tris-HCl) v koncentraci 25 mM. To udržuje pH roztoku na téměř fyziologické hodnotě 8,0, což je ideální pH pro zabránění kyselé hydrolýze (degradaci) plazmidové DNA a nežádoucím vedlejším reakcím ostatních složek buněk.
EDTA zabraňuje degradaci DNA
EDTA nebo kyselina ethylendiamintetraoctová zachycuje nebo „chelátuje“ kovové ionty z roztoku a brání jim v účasti na nežádoucích vedlejších reakcích. V pufru GTE se přidá EDTA v koncentraci 10 mM. Jeho primárním účelem je v pufru zaokrouhlit volný zinek, hořčík a vápník, čímž zabrání degradaci DNA určitými cestami, které tyto kovy vyžadují.
Několik důležitých tipů
Udržujte svůj GTE pufr chladný a připravujte jej v malém množství, abyste zabránili růstu nechtěných bakterií. Cukr a kontrolované pH vytvářejí skvělé růstové médium. Vždy používejte vyčištěnou vodu. Voda z vodovodu může mít z trubek přebytek kovových iontů, což může přemoci schopnost EDTA zachytit. Pokud máte podezření na přítomnost interferující RNA ve vašem vzorku, přidejte RNázu A v dávce 100 mikrogramů na mililiter do svého GTE pufru, abyste problém odstranili.
