Sekvenování DNA: Definice, metody, příklady

Nukleotidy jsou chemickými stavebními kameny života a nacházejí se v DNA živých organismů. Každý nukleotid se skládá z cukr, fosfát a báze obsahující dusík: adenin (A), thymin (T), cytosin (C) a guanin (G). Specifické pořadí těchto nukleotidových bází určuje, které proteiny, enzymy a molekuly budou buňkou syntetizovány.

Stanovení pořadí nebo sekvence nukleotidů je důležité pro studium mutace, vývoj, progrese nemoci, genetické testování, forenzní vyšetřování a medicína.

Genomika je studium DNA, genů, genových interakcí a vlivů prostředí na geny. Tajemstvím odhalení složitého vnitřního fungování genů je schopnost identifikovat jejich strukturu a umístění na chromozomech.

Plán živých organismů je určen řádem (nebo sekvencí) párů bází nukleových kyselin v DNA. Když se DNA replikuje, adenin se páruje s tyminem a cytosin s guaninem; jsou považovány neshodné páry mutace.

Od dvojité šroubovice deoxyribonukleová kyselina Molekula (DNA) byla konceptualizována v roce 1953, došlo k dramatickým zlepšením v oblasti genomiky a sekvenování DNA ve velkém měřítku. Vědci pilně pracují na aplikaci těchto nových poznatků do individualizované léčby nemocí.

Současné diskuse zároveň umožňují vědcům zůstat před etickými důsledky těchto rychle explodujících technologií.

Sekvenování DNA je proces objevování sekvence různých nukleotidových bází ve fragmentech DNA. Sekvenování celého genu umožňuje srovnání chromozomů a genomů přítomných u stejných a různých druhů.

Mapování chromozomů je užitečné pro vědecký výzkum. Analýza mechanismů a struktury geny„Alely a chromozomální mutace v molekulách DNA navrhuje například nové způsoby léčby genetických poruch a zastavení růstu rakovinných nádorů.

Metody sekvenování DNA Fredericka Sangera od sedmdesátých let výrazně pokročila v oboru genomiky. Po úspěšném sekvenování RNA při studiu inzulínu se Sanger cítil připraven řešit sekvenování DNA. Sanger nebyl prvním vědcem, který se zabýval sekvenováním DNA. Jeho chytré metody sekvenování DNA - vyvinuté ve spolupráci s kolegy Bergem a Gilbertem - však v roce 1980 získaly Nobelovu cenu.

Sanger znal potenciální hodnotu své práce a často spolupracoval s dalšími vědci, kteří sdíleli jeho zájmy v DNA, molekulární biologie a vědy o životě.

Ačkoli byly Sangerovy metody sekvenování DNA pomalé a drahé ve srovnání s dnešními sekvenčními technologiemi, byly v té době chváleny. Po pokusech a omylech našel Sanger tajný biochemický „recept“ na oddělení řetězců DNA, vytvoření více DNA a identifikaci pořadí nukleotidů v genomu.

Vysoce kvalitní materiály lze snadno zakoupit pro použití v laboratorních studiích:

• DNA polymeráza je enzym potřebný k výrobě DNA.
• DNA primer řekne enzymu, kde má začít pracovat na řetězci DNA.
• dNTP jsou organické molekuly vyrobené z deoxyribózového cukru a nukleosid trifosfátů - dATP, dGTP, dCTP a dTTP - které shromažďují bílkoviny
• Ukončovací řetězy jsou barvivo zbarvené nukleotidy, nazývané také terminátorové nukleotidy pro každou bázi - A, T, C a G.

Sanger přišel na to, jak rozřezat DNA na malé segmenty pomocí enzymu DNA polymerázy.

Poté vyrobil více DNA ze šablony a do nové DNA vložil radioaktivní stopovače, aby vymezil části oddělených řetězců. Rovněž uznal, že enzym potřebuje primer, který by se mohl vázat na konkrétní místo na řetězcovém řetězci. V roce 1981 se Sanger znovu zapsal do historie zjišťováním genomu 16 000 párů bází mitochondriální DNA.

Během procesu sekvenování musí být teplota pečlivě nastavena. Nejprve se do trubice přidají chemikálie a zahřejí se, aby se dvojvlákno rozmotalo (denaturovalo) Molekula DNA. Poté se teplota ochladí, což umožní spojení primeru.

Dále se teplota zvýší, aby se podpořila optimální aktivita DNA polymerázy (enzymu).

Polymeráza typicky používá běžné dostupné nukleotidy, které se přidávají ve vyšší koncentraci. Když se polymeráza dostane k „řetězci zakončujícímu“ barvivem vázanému nukleotidu, polymeráza se zastaví a tam končí řetězce, což vysvětluje, proč se obarvené nukleotidy nazývají „zakončení řetězce“ nebo „Terminátoři.“

Proces pokračuje mnohokrát. Nakonec byl nukleotid vázaný na barvivo umístěn do každé jednotlivé polohy sekvence DNA. Gelová elektroforéza a počítačové programy pak mohou identifikovat barvy barviva na každém z řetězců DNA a Zjistěte celou sekvenci DNA na základě barviva, polohy barviva a délky prameny.

Vysoce výkonné sekvenování - obecně označované jako sekvenování nové generace - využívá nové pokroky a technologie k sekvenování nukleotidových bází rychleji a levněji než kdykoli předtím. Stroj na sekvenování DNA snadno zvládne rozsáhlé úseky DNA. Ve skutečnosti lze celé genomy zvládnout během několika hodin, místo let pomocí Sangerových sekvenčních technik.

Metody sekvenování nové generace zvládnou analýzu velkoobjemové DNA bez dalšího kroku amplifikace nebo klonování, aby se získalo dostatek DNA pro sekvenování. Stroje na sekvenování DNA provádějí více sekvenčních reakcí najednou, což je levnější a rychlejší.

Nová technologie sekvenování DNA v zásadě spouští stovky Sangerových reakcí na malém, snadno čitelném mikročipu, který je poté spuštěn přes počítačový program, který sekvenci sestavuje.

Tato technika čte kratší fragmenty DNA, ale je stále rychlejší a efektivnější než Sangerovy metody sekvenování, takže lze rychle dokončit i rozsáhlé projekty.

The Projekt lidského genomu, dokončená v roce 2003, je jednou z nejznámějších sekvenčních studií, které byly dosud provedeny. Podle článku z roku 2018 v Vědecké zprávy, lidský genom se skládá z přibližně 46 831 genů, což byla impozantní výzva k posloupnosti. Špičkoví vědci z celého světa strávili téměř 10 let spoluprací a konzultacemi. Pod vedením Národního výzkumu lidského genomu

Institute, projekt úspěšně zmapoval lidský genom pomocí složeného vzorku odebraného od anonymních dárců krve.

Projekt lidského genomu se při mapování párů bází spoléhal na metody sekvenování bakteriálních umělých chromozomů (na bázi BAC). Tato technika používala bakterie ke klonování fragmentů DNA, což vedlo k velkému množství DNA pro sekvenování. Velikost klonů byla poté zmenšena, umístěny do sekvenčního stroje a sestaveny do úseků představujících lidskou DNA.

Nové objevy v genomice zásadně mění přístupy k prevenci, detekci a léčbě nemocí. Vláda vyčlenila miliardy dolarů na výzkum DNA. Donucovací orgány se při řešení případů spoléhají na analýzu DNA. Soupravy pro testování DNA lze zakoupit pro domácí použití k výzkumu původu a identifikaci genových variant, které mohou představovat zdravotní rizika:

• Genomická analýza znamená srovnání a srovnání genomových sekvencí mnoha různých druhů v doménách a královstvích života. Sekvenování DNA může odhalit genetické vzorce, které vrhají nové světlo na evoluční zavedení určitých sekvencí. Předky a migraci lze vysledovat pomocí analýzy DNA a porovnat s historickými záznamy.

• Pokroky v medicíně se dějí exponenciální rychlostí, protože prakticky každá lidská nemoc má genetickou složku. Sekvenování DNA pomáhá vědcům a lékařům pochopit, jak více genů interaguje navzájem a s prostředím. Rychlé sekvenování DNA nového mikroba způsobujícího propuknutí nemoci může pomoci identifikovat účinné léky a vakcíny, než se problém stane vážným problémem v oblasti veřejného zdraví. Genové varianty v rakovinných buňkách a nádorech by mohly být sekvenovány a použity k vývoji individualizovaných genových terapií.

• Forenzní věda aplikace se používají k tomu, aby donucovacím orgánům pomohly vyřešit tisíce obtížných případů od konce 80. let, uvádí Národní institut spravedlnosti. Důkazy z místa činu mohou obsahovat vzorky DNA z kostí, vlasů nebo tělních tkání, které lze porovnat s profilem DNA podezřelého, což pomůže určit vinu nebo nevinu. Polymerázová řetězová reakce (PCR) je běžně používanou metodou pro vytváření kopií DNA ze stopových důkazů před sekvenováním.

• Sekvenování nově objevených druhů může pomoci určit, které další druhy mají nejbližší vztah, a odhalit informace o evoluci. Taxonomové používají ke klasifikaci organismů „čárové kódy“ DNA. Podle University of Georgia v květnu 2018 se odhaduje na 303 druhů savců.

• Genetické testování na nemoci hledat mutované genové varianty. Většinou jde o jednonukleotidové polymorfismy (SNP), což znamená, že pouze jeden nukleotid v sekvenci je změněn z „normální“ verze. Faktory prostředí a životní styl ovlivňují, jak a zda jsou určité geny exprimovány. Globální společnosti zpřístupňují špičkové technologie sekvenování nové generace vědcům z celého světa, kteří se zajímají o multigenové interakce a sekvenování celého genomu.

• Genealogické soupravy DNA používají sekvence DNA ve své databázi ke kontrole variant v genech jednotlivce. Souprava vyžaduje vzorek slin nebo tampon na tvář, který je odeslán do komerční laboratoře k analýze. Kromě informací o původu mohou některé soupravy identifikovat jednonukleotidové polymorfismy (SNP) nebo jiné dobře známé genetické varianty, jako jsou geny BRCA1 a BRCA2 spojené se zvýšeným rizikem pro ženský prsa a rakovina vaječníků.

Nové technologie často přicházejí s možností sociálních dávek i škod; Mezi příklady patří nefunkční jaderné elektrárny a jaderné zbraně hromadného ničení. Technologie DNA přicházejí také s riziky.

Emocionální obavy ohledně nástrojů pro sekvenování DNA a úpravy genů, jako je CRISPR, zahrnují obavy, že technologie může usnadnit lidské klonování nebo vést k mutantním transgenním zvířatům vytvořeným darebákem vědec.

Etické problémy spojené se sekvenováním DNA se častěji týkají informovaného souhlasu. Snadný přístup k testování DNA přímo spotřebiteli znamená, že spotřebitelé nemusí plně pochopit, jak budou jejich genetické informace použity, uloženy a sdíleny. Laici nemusí být emocionálně připraveni dozvědět se o svých defektních variantách genů a zdravotních rizicích.

Třetí strany, jako jsou zaměstnavatelé a pojišťovny, by mohly potenciálně diskriminovat jednotlivce, kteří nesou vadné geny, které by mohly vést k vážným zdravotním problémům.