Tris nebo tris (hydroxymethyl) aminomethan je běžný biologický pufr používaný během procesu extrakce DNA. Během extrakce z jakéhokoli počtu zdrojů je DNA citlivá na pH. Během buněčné lýzy, odstraňování nežádoucích buněčných složek a srážení se tris používá k udržení stabilního pH. Navíc hraje zvláště důležitou roli při lýze buněk.
TL; DR (příliš dlouhý; Nečetl)
Extrakce DNA je proces citlivý na pH a použití pufru tris pomáhá udržovat stabilní pH při lýze a extrakci buněk.
Tris jako nárazník
Protože pH může ovlivnit a být ovlivněno řadou buněčných faktorů, je udržování stabilního pH pro experimentální vědu nezbytné. Biologické pufry, jako je tris, jsou důležité, protože mohou udržovat stabilní pH i přes vlivy, které by jinak mohly pH změnit. Tris (hydroxymethyl) aminomethan, s pKa 8,1, je účinný pufr mezi pH 7 a 9. Vzhledem ke svému neutrálnímu rozmezí je tris běžně používaným pufrem v biologických laboratořích. Pufr tris je však citlivý na teplotu a měl by se používat při teplotě, při které byl původně pH upraven, aby se předešlo nepřesnostem.
Lýza buněk
Lýza nebo rozbití buněk je prvním krokem extrakce DNA. Toho je dosaženo pufrem obsahujícím tris a EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová). EDTA váže dvojmocné kationty, jako je vápník a hořčík. Protože tyto ionty pomáhají udržovat integritu buněčné membrány, jejich eliminace pomocí EDTA destabilizuje membránu. Tris je hlavní vyrovnávací složkou; jeho hlavní úlohou je udržovat pH pufru na stabilním místě, obvykle 8,0. Navíc, tris pravděpodobně interaguje s LPS (lipopolysacharidem) v membráně a slouží k destabilizaci membrány dále.
Tris Chrání DNA před změnami pH
Když se buňky rozpadnou, jejich DNA a obsah se vylijí do pufru. Navíc jsou často zahrnuty RNáza A (ničí RNA), proteázy (ničí proteiny) a SDS (dodecylsulfát sodný, solubilizuje fragmenty membrány). Dohromady tato polévka s buněčným obsahem a fragmentovanou RNA a bílkovinami může mít velký vliv na pH roztoku. Protože DNA je citlivá na pH, je důležité, aby tris tlumila polévku a udržovala pH na stabilním místě.
Srážení DNA
V závěrečné fázi extrakce DNA se z roztoku extrahuje samotná DNA. V tomto okamžiku je DNA rozpustná v pufru. Pro extrakci z roztoku je DNA nerozpustná přidáním ethanolu nebo isopropanolu (isopropylalkoholu). Když je to hotové, DNA se v roztoku stane zjevnou jako bílá vláknitá látka. Ačkoli DNA může být izolována ze zbývajících buněčných složek tímto způsobem, není „použitelná“, pokud je nerozpustná. Po izolaci je alkohol odstraněn a DNA musí být vrácena do biologického pufru, jako je tris, aby mohla být použita.
Udělej si sám
Ačkoli se extrakce DNA běžně provádí ve výzkumných laboratořích obecně pomocí jednoho z mnoha komerčně dostupné soupravy může kdokoli provádět extrakci DNA doma pomocí běžných předmětů pro domácnost a zeleně hrášek nebo špenát. V tomto případě není přítomen tris ani žádný biologický pufr, který chrání DNA před změnami pH. Jedná se však o vizuální způsob, jak pomoci studentům spojit se s buněčnou DNA.