Genetický plán buňky je zakódován do jejího genetického materiálu nebo DNA. Protože DNA nikdy neopouští jádro buňky, aby se tyto informace dostaly do cytoplazmy, kde jsou jiné bílkoviny a biochemické složky jsou uloženy, je nutné nejprve transkribovat DNA na messenger RNA (mRNA nebo poly (A) RNA). Tato mRNA se poté přemění na proteiny, které vykonávají mnoho funkcí buňky. Chcete-li detekovat nebo kvantifikovat velmi vzácné mRNA, vyrobit sondy pro mikročipy nebo vytvořit knihovny komplementárních molekul DNA, musí být mRNA izolována. Extrakce celkové RNA (tj. Veškeré RNA v buňce) a následná izolace mRNA však nejsou vzájemně se vylučující procesy; první musí být provedeno, aby bylo možné extrahovat mRNA.
Homogenizace TRIzol: Celková RNA zahrnuje veškerou mRNA, přenosovou RNA, ribozomální RNA a další nekódující RNA. Aby se buňky oddělily od ostatních buněčných složek, nejdříve se roztrhnou, aby uvolnily své obsah. Toho se dosáhne resuspendováním buněk peletovaných centrifugací (odstřeďováním při vysokých rychlostech) v TRIzol Reagent (Life Technologies). Podobně fungují i jiné verze TRIzolu (například Ambion’s TRI Reagent).
Celková izolace RNA: K oddělení různých složek (proteinů, DNA, RNA) buňky do vrstev nebo fází v suspenzi se používá řada centrifugací. Horní žlutě zbarvená fáze je složena z tuku a lze ji zlikvidovat. Požadovaná fáze je zbarvena červeně, obsahuje celkovou RNA a je zachována. Po provedení extrakce fenol-chloroformem a sérii promytí alkoholem s použitím isopropanolu a ethanolu může být RNA peletována pro izolaci mRNA. Přidejte inhibitory RNázy, abyste zabránili tomu, aby tento enzym degradoval celkovou RNA.
Extrakce mRNA: K izolaci mRNA je běžné používat soupravu, protože domácí laboratorní protokoly negenerují velké množství vysoce purifikovaných mRNA. Komerční sady zahrnují Invitrogen's FastTrack 2.0 nebo Ambion’s Poly (A) Pure mRNA Isolation Souprava. U těchto sad jsou společné tyto základní kroky:
d) Odstřeďte tento vzorek a izolujte supernatant, který se několikrát promyje řadou vazebných pufrů a pufrů s nízkým obsahem soli poskytnutých v soupravách.
Reference
- "cDNA Library Protocols?"; Ian G. Cowell a Caroline A. Austin; 1997
- „In vitro transkripční a překladové protokoly?“; Martin J. Tymms; 1995
Tipy
- Uchovávejte všechny reagencie, buňky a RNA chladné ponořením do ledu. To zabrání degradaci RNA jinými enzymy, které se uvolní během procesu homogenizace.
Varování
- Reagencie, jako je TRIzol, jsou toxické a nesmí přijít do styku s kůží nebo sliznicemi. Při manipulaci s tímto činidlem vždy dodržujte bezpečné laboratorní protokoly.
o autorovi
Palmer Owyoung je držitelem titulu Master of Arts v mezinárodním obchodu na Kalifornské univerzitě v San Diegu a Bakalář umění v sociologii z University of California v Santa Barbaře a je vyškolený molekulár biolog. Od roku 2006 je spisovatelem na volné noze. Kromě psaní se věnuje obchodování na Forexu a internetovému marketingu na plný úvazek.
Fotografické kredity
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images