Vysoce účinná kapalinová chromatografie je technika pro laboratorní analýzu směsi. Jedná se o efektivní typ chromatografie, který využívá vysoký tlak namísto pouhé gravitace k pohánění vzorku směsi přes kolonu. Vstřikuje se vzorek, poté čerpadlo obsahující vysoké množství tlaku pomáhá pohybovat vzorkem po naplněné koloně, kde je rozdělen na jednotlivé složky. Tato separace se poté analyzuje detektorem, aby se získaly výsledky.
Místo vpichu
Aby bylo možné injektovat do HPLC, musí být vzorek nejprve rozpuštěn v polárním kapalném rozpouštědle, nejlépe v rozpouštědle se známými spektry HPLC, aby bylo možné odlišit jeho údaje od vzorků. Kapalný roztok obsahující vzorek se umístí do přístroje a odešle se do kolony. Skutečné umístění místa vpichu závisí na značce nástrojů. Ve většině případů je proces injekce automatizovaný, ale v některých případech musí pracovník laboratoře vstříknout vzorek pomocí malé jehly injekční stříkačky.
Součást čerpadla
Složka čerpadla jednotky HPLC je nezbytná, protože poskytuje tlak, který pohání vzorek kolonou. Síla čerpadla se liší, ale výkonné čerpadlo může vytvářet tlak až 6 000 psi nebo liber na čtvereční palec, který se aplikuje po vstříknutí vzorku. To umožňuje, aby vzorek procházel kolonou rychleji a efektivněji, než kdyby kapal skrz pouze pomocí gravitační síly.
Popis sloupce
Zvýšená rychlost vzorku procházejícího kolonou čerpadlem umožňuje použití jiného typu kolony, než jaké se používají v jednoduché kapalinové chromatografii. Obalový materiál ve sloupci může mít mnohem menší velikost částic, což zvětšuje povrch a proto napomáhá interakci vzorku s kolonou. Většina HPLC kolon pracuje přes polaritu. Vzorek se rozpustí v polárním rozpouštědle a kolona se skládá z převážně nepolárních uhlovodíků. Polární části molekuly vzorku procházejí kolonou velmi rychle, protože primárně interagují s rozpouštědlo, zatímco nepolární složky vzorku zůstávají ve sloupci a vytvářejí slabé interakce s kolonou komponenty. Proto komponenty vzorku pocházejí ze sloupce v pořadí od nejvíce polárních po nejvíce nepolární.
Funkce detektoru
Detektory se také liší podle typu použitého HPLC nástroje. Většina však funguje stejným základním způsobem. Jakmile ultrafialové světlo vyjde z kolony, svítí na jednotlivé složky vzorku. Většina organických sloučenin absorbuje určité množství světla, takže při průchodu aplikovaným světelným paprskem může detektor zachytit, kolik světla je absorbováno. Detektor také zaznamenává retenční čas komponent na základě pořadí, ve kterém vyjdou ze sloupce. Tento výstup lze poté analyzovat na základě plochy píku a určit přesnou povahu složek vzorku.